堆肥中生物酶基因多样性的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，包括以下步骤：首先提取堆肥中的微生物总ＤＮＡ，该提取过程又包括样品的脱腐、ＤＮＡ的粗提和ＤＮＡ的纯化三个步骤；然后利用ＰＣＲ扩增程序对特定生物酶基因进行扩增；再在１×ＴＡＥ缓冲液中，６０℃恒温、１００Ｖ恒压条件下运行变性梯度凝胶电泳１２～１４ｈ；最后对变性梯度凝胶电泳图谱进行分析，确定所述堆肥中特定生物酶基因的多样性。本发明专利技术的分析方法具有高通量、低成本、简便直观等优点，以便于更好地表征堆肥中具有降解功能的微生物种群。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因多样性的方法，尤其涉及一种堆肥微生物总DNA中基因多样性的 分析方法。
技术介绍
堆肥是利用微生物对可生物降解固体废物进行分解，从而对其实现最终处理的一种系统， 因此，充分认识其中的微生物学原理能为改进处理工艺、提高处理效率提供依据。对堆肥进 行微生物群落研究的传统方法主要是微生物培养和纯种分离技术。因为环境中的绝大多数微 生物无法通过培养方法进行研究，而且堆肥中微生物种类繁多，常处于动态变化状态，培养 研究无法反映系统中微生物种群的动态变化，因此，这样的研究方法无法满足堆肥微生物学 研究的要求。分子生态学技术正是一种能不依赖于微生物分离培养而对其进行研究的新技术。目前， 分子生态学研究已经涉及至U环境科学研究的众多领域，包括在堆肥微生物分子生态学方面的 研究。变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)正是其中应用最为 广泛的一项技术，其原理是DNA进行电泳时使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶， 该凝胶能够有区别地解链PCR扩增产物。长度相同而在碱基序列上存在差异的不同DNA在 进行变性梯度凝胶电泳时，会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化。DNA 双链一旦解链，DNA分子形成端部的叉状或中间的环形，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度 将会急剧下降；以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开 的条带，这样便能将具有相同长度而序列有差异的DNA分子分离开。该技术可以分辨具有 相同或相近分子量的目的片段序列差异，可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及 PCR扩增DNA片段的多态性。目前，对环境中功能基因的分离和多样性的研究还要结合构建克隆文库的方法，但是该 方法却不适合对堆肥过程中多种功能基因的分离和多样性的研究，其原因在于构建一个克 隆文库必须一次性挑取几十甚至上百个克隆子，而堆肥又是一个不断变化的动态过程，因此， 如果要对堆肥过程中的多个功能基因进行分离以及进行后续的多样性研究就必须构建多个克 隆文库，这不仅大大增加了工作量， 一定程度上还会增加实验成本。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高通量、低成本、简便直观的，以便于更好地表征堆肥中具有降解功能(例如木质 素的降解等)的微生物种群。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为一种堆肥中生物酶基因多样性的分析方 法，包括以下步骤首先提取堆肥中的微生物总DNA,该微生物总DNA的提取过程又包括 样品的脱腐、DNA的粗提和DNA的纯化三个步骤；然后利用PCR扩增程序对特定生物酶基 因进行扩增；再在lxTAE缓冲液中，6(TC恒温、100V恒压条件下运行变性梯度凝胶电泳 12~14h;最后对变性梯度凝胶电泳图谱进行分析，确定所述堆肥中特定生物酶基因的多样性。上述的，具体包括以下步骤-(1) 提取堆肥中的微生物总DNA样品的脱腐向待提取DNA的堆肥样品中以8 15ml/g堆肥的用量加入去腐缓冲液，然后 置于60~65 'C的水浴中保温3 8 min，保温期间可将样品与去腐缓冲液轻轻搅匀，再以 3000 5000 xg离心5 7min，去上清；重复本步骤直至离心后的上清颜色与所述去腐缓冲液的 颜色无明显差异(一般重复1 2次即可满足要求)；DNA的粗提将上述脱腐后的样品置于液氮中保持3 5min，然后以60~65'C的温度解冻 15-20 min;以1.0~1.5 ml/g堆肥的用量加入DNA提取缓冲液，并在37'C温度下以20(K250 rpm 振荡45 60min;然后以100~150 td/g堆肥的用量加入十二烷基硫酸钠溶液(简称SDS，其W/V 浓度优选为10%)得混合液，65'C水浴1.0 1.5h，水浴时可每隔10 15min上下轻轻颠倒一次； 再加入与所述混合液等体积的氯仿-异戊醇试剂(氯仿与异戊醇的V/V为24:1)，摇匀后(至乳 状)以8000~12000 xg离心至沉淀完全，回收水相；往回收的水相中加入0.6倍水相体积的异丙 醇并沉淀l 2h，以10000~13000 xg速度离心8 15 min;离心后的沉淀以0.8~1.5 ml/g堆肥的用 量加入预冰冷的乙醇溶液(V/V为70。/。)进行洗涤，以10000 13000 xg速度离心3 5min,然后 以500~1000 pl/g堆肥的用量将洗涤后的堆肥样品溶于TE缓冲液中，得到粗提的DNA溶液；DNA的纯化用试剂盒对上述粗提的DNA溶液进行纯化，在纯化产物中加入终浓度为 0.25~0.5 pg/ml的核糖核酸酶A (RnaseA)， 37'C水浴中消化30^40 min以除去RNA,得到纯化 后的堆肥微生物总DNA;(2) PCR扩增生物酶基因选用一对用于特定生物酶基因PCR扩增的简并引物，并在其上游引物的5'端加上GC发 卡结构(GC发卡结构主要作用是使PCR产物的一侧产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的 序列处于低熔点区，从而有利于DGGE对扩增出来的基因序列进行分离)；再利用PCR扩增 程序对该特定生物酶基因进行扩增；由于拟分析的特定生物酶基因的不同，在PCR引物的设计和选用上会存在差异，对于研 究较多的生物酶基因的引物可直接通过查阅文献获得；而对于研究较少的生物酶基因的引物 可自行通过专业软件进行设计；(3) 变性梯度凝胶电泳电泳在通用突变检测系统中进行，所用胶浓度为10% (质量浓度)的聚丙烯酰胺(配制 胶的溶液含有丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺和50xTAE，最后加灭菌双蒸水补足至所需的浓 度)，变性梯度为30%~60%;电泳运行后的凝胶用SYBR Green I染色20 30min，经凝胶成像 系统拍照得到DNA指纹图谱；(4) 变性梯度凝胶电泳图谱分析将变性梯度凝胶电泳条带切下，用无菌水清洗，并用TE缓冲液(一般为20~30pL)将 所述条带浸泡过夜；以浸泡出的DNA溶液为模板，以步骤(2)中的简并引物(不带GC发 夹结构)作为扩增用引物，利用PCR扩增程序扩增条带中所述特定生物酶基因片段；用试剂 盒纯化回收PCR产物，然后将该产物进行基因测序和Blast比对，确定所述堆肥中特定生物 酶基因的多样性。上述技术方案中，所述的特定生物酶基因优选为漆酶(丄wca^)基因，其对应的所述简 并引物和GC发卡结构如下上游引物5'-CAYTGGCAYGGNTTYTTYCA-3' 下游引物5'-GRCTGTGGTACCAGAANGTNCC-3'GC发卡结构5，國CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGG-3'。上述技术方案中，所述PCR扩增程序为起始95t:预变性5min; 94'C变性lmin， 50°C 引物复性lmin， 72。C引物延伸lmin， 35个循环；72。C延伸5min。上述技术方案中，所述去腐缓冲液是由作为溶质的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、 焦磷酸钠(Na4P207)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氯化钠 (NaCl)、曲拉通X -100 (Triton X-100)与溶剂水配制而成，各溶质组分在去腐缓冲液中 的浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，包括以下步骤：首先提取堆肥中的微生物总ＤＮＡ，该微生物总ＤＮＡ的提取过程又包括样品的脱腐、ＤＮＡ的粗提和ＤＮＡ的纯化三个步骤；然后利用ＰＣＲ扩增程序对特定生物酶基因进行扩增；再在１×ＴＡＥ缓冲液中，６０℃恒温、１００Ｖ恒压条件下运行变性梯度凝胶电泳１２～１４ｈ；最后对变性梯度凝胶电泳图谱进行分析，确定所述堆肥中特定生物酶基因的多样性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范长征，曾光明，杨春平，梁婕，杨朝晖，李凤，李贞，肖勇，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]