一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法及肌氨酸检测方法技术

本发明专利技术公开一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法，包括：将硅藻培养到所需的细胞密度后将金和铜经过硅藻的生长代谢插入到硅藻壳中得到含金和铜的硅藻壳Au/Cu

【技术实现步骤摘要】
一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法及肌氨酸检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法及肌氨酸检测方法。

技术介绍

[0002]表面增强拉曼(Surface
‑
Enhanced Raman Scattering，SERS)是一种强大的光谱技术，具有高灵敏度和选择性的优势，可以检测感兴趣的物质。据报道，一些纳米复合材料充当SERS基材，用于原位监测催化反应过程。然而，很少有报道涉及纳米材料同时充当SERS基材和催化剂。
[0003]SERS基材的特点是分布具有严格排列和精度的纳米图案，这意味着只能依赖非常昂贵的自上而下的纳米制造技术。而硅藻，一种身披硅质细胞壁外壳的单细胞藻类，给SERS基材提供了独特的机会。硅藻壳具有独特的理化特性，孔隙率高，壳面分布着微米级至纳米级的孔径，比表面积大，良好的机械硬度及特殊的光谱吸收。能够通过自我复制而产生大量具有相同复杂微结构和纳米结构的二氧化硅硅藻壳。硅藻壳的高再现率保证了大量非常复杂的微结构和纳米结构的可用性，可以安全、低廉的生产方式获得SERS基材。
[0004]适当的金属化修饰，能够提供纳米材料类似过氧化物酶的催化性能同时提高SERS性能。硅藻壳不仅可以为纳米颗粒的沉积提供支撑，而且作为纳米颗粒沉积的基底，能显著提高金属纳米颗粒的催化活性，同时硅藻壳的多孔晶体结构也增强了纳米酶的酶活性。Au NPs(Au nanoparticles)和Ag NPs(Ag nanoparticles)分别沉积至硅藻壳的应用，已证实其增强表面拉曼光谱的能力。然而金属化修饰过程通常需要通过化学方法合成对应金属纳米颗粒，再通过有机试剂将金属纳米颗粒与硅藻壳进行连接。现有的制备过程繁琐且具有相对较长的反应时间，使用的试剂对人有害。需要寻找更为绿色、酶活更高的形式，将金属纳米颗粒与纳米材料进行结合。以此，获得能够应用至临床癌症筛查的技术中去。
[0005]前列腺癌临床筛查主要依靠前列腺特异抗原(PSA)的定量检测、穿刺活检术及直肠指检。虽然前列腺特异性抗原(PSA)的检测被广泛应用，但它的存在仅能提示前列腺疾病的存在(前列腺炎症、良性增生等因素都会造成PSA水平的异常)，而不具有前列腺癌特异性。对于穿刺活检和直肠指检，这两种筛查方法操作繁琐，具有侵入性，患者就医体验较差。
[0006]开发体外诊断技术(in vitro diagnostics,IVDs)以指导早期诊断和更有效的临床干预，可以很好的弥补当前侵入性诊断技术的不足。由于各种原因，癌症的IVDs发展缓慢。部分原因是缺乏已知的强大的生物标志物，可以作为诊断的目标。在快速筛查前列腺癌的相关专利中，多使用核酸标志物进行研究，未检索到以肌氨酸为筛查标志物进行设计的专利。
[0007]此外肌氨酸已被证明是早期PCa的临床标志物，其在尿液中的水平允许简单和非侵入性的早期诊断。一般来说，在正常生理条件下，肌氨酸在人类尿液中以1
‑3×
10
‑
6mol
·
L
‑
1的浓度产生，而在PCa的病理过程中，肌氨酸只会增加不到一个数量级。此外，探针通常
容易受到临床样本中可能共存生物分子的大量干扰。因此，很难准确区分肌氨酸的微小浓度变化，导致错误阳性/阴性诊断的风险。这些问题使临床样本中对肌氨酸的敏感和特异性检测具有挑战性，但意义重大。

技术实现思路

[0008]本专利技术实施例提供一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法，包括：
[0009]步骤一、将硅藻培养到所需的细胞密度后将金和铜经过硅藻的生长代谢插入到硅藻壳中得到含金和铜的硅藻壳Au/Cu
‑
DF，使得硅藻壳新陈代谢过程中产生的氧化还原产物将含有金和铜的金属溶液还原成为金和铜沉积至硅藻壳表面形成纳米颗粒；
[0010]步骤二、将可以靶向硅藻壳成分的硅亲和标记标签T8标签和R5标签与肌氨酸氧化酶进行融合得到重组后的T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶；
[0011]步骤三、将T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶固定在包含金和铜纳米颗粒的硅藻壳上进行组装形成双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器。
[0012]进一步地，步骤一包括：
[0013]在培养基中加入预设浓度的Si得到f/2+Si培养基，将硅藻细胞在f/2+Si培养基中生长，当可用的硅被消耗掉时达到所需细胞密度的硅藻；
[0014]将氯金酸和偏硅酸钠共同输送到培养基中，在25摄氏度，光暗周期12小时的条件培养3天，以不同地时间间隔向培养基中加入氯金酸，直至氯金酸的最终浓度为5μmol/L，且培养基颜色完全变成紫红色后将硅藻转移到新鲜的f/2培养基中；
[0015]向培养基中加入CuSO4，直至浓度为5μmol/L且当培养基颜色完全变为暗黑色时培养结束；
[0016]离心培养液，收集含金和铜纳米颗粒的硅藻细胞，用EDTA/SDS和H2O2/HCl处理细胞，去除有机成分，分离得到含金和铜的硅藻壳Au/Cu
‑
DF。
[0017]进一步地，步骤二包括：
[0018]将肌氨酸氧化酶单体的C端和N端序列插入二氧化硅亲和肽以及组蛋白标签his tag，其中，his tag用于蛋白质纯化；
[0019]将硅亲和标记T8标签和R5标签融合到肌氨酸氧化酶得到T8重组肌氨酸氧化酶和R5T8重组肌氨酸氧化酶，其中，R5 tag来组硅藻Claviceps fusiformis的全长R5肽，T8 tag来自硅藻Thalassiosira pseudonana的SiI3 T8，R5 tag和T8 tag能够靶向硅藻壳silaffin
‑
3成分。
[0020]进一步地，步骤三包括：
[0021]使用缓冲盐溶液配置硅藻壳溶液，超声；
[0022]向硅藻壳溶液中加入T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶使浓度介于0.05
‑
0.5mg/mL之间，涡旋振荡混合，置于室温沉淀，离心，得到双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器。
[0023]一种肌氨酸的检测方法，包括：
[0024]将待检测的肌氨酸、TMB和MES缓冲液加入到权利要求1
‑
4任一项所述的构建方法制备得到的双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器悬浮液中反应至少15min，离心，使用UV
‑
vis检测上清液在652nm处的吸光度；
[0025]在96孔板中加入双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器和TMB的混合物，吹打混匀后加入不同浓度的肌氨酸，孵育至少10min后，滴在清洗干净的干燥的载玻片上，室温干燥；
[0026]通过拉曼光谱仪测定反应后双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的拉曼信号。
[0027]本专利技术提供一种同时充当SERS基材和催化剂的纳米材料。利用蛋白质工程提供肌氨酸酶靶向固定至硅藻壳的能力，本专利技术开发了一种基于生物沉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法，其特征在于，包括：步骤一、将硅藻培养到所需的细胞密度后将金和铜经过硅藻的生长代谢插入到硅藻壳中得到含金和铜的硅藻壳Au/Cu
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DF，使得硅藻壳新陈代谢过程中产生的氧化还原产物将含有金和铜的金属溶液还原成为金和铜沉积至硅藻壳表面形成纳米颗粒；步骤二、将可以靶向硅藻壳成分的硅亲和标记标签T8标签和R5标签与肌氨酸氧化酶进行融合得到重组后的T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶；步骤三、将T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶固定在包含金和铜纳米颗粒的硅藻壳上进行组装形成双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤一包括：在培养基中加入预设浓度的Si得到f/2+Si培养基，将硅藻细胞在f/2+Si培养基中生长，当可用的硅被消耗掉时达到所需细胞密度的硅藻；将氯金酸和偏硅酸钠共同输送到培养基中，在25摄氏度，光暗周期12小时的条件培养3天，以不同地时间间隔向培养基中加入氯金酸，直至氯金酸的最终浓度为5μmol/L，且培养基颜色完全变成紫红色后将硅藻转移到新鲜的f/2培养基中；向培养基中加入CuSO4，直至浓度为5μmol/L且当培养基颜色完全变为暗黑色时培养结束；离心培养液，收集含金和铜纳米颗粒的硅藻细胞，用EDTA/SDS和H2O2/HCl处理细胞，去除有机成分，分离得到含金和铜的硅藻壳Au/Cu
‑
DF。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨雪薇，罗艳青，穆罕默德，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：