一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法及其应用，属于荧光探针技术领域，该材料对于标记脂滴具有更好的光稳定性以及成像效果，其结构由通式(A)表示，本发明专利技术的荧光探针分子具有合成简单、原料价廉、产率高和光物理性质好的优点。相比于商业化脂滴探针BODIPY493/503和NileRed，本发明专利技术所制备的基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料克服了常规脂滴检测材料在脂滴处聚集时易造成荧光强度的衰减甚至淬灭，并且光稳定性较差，难以获得脂滴形态的超高分辨成像等技术问题，具有更好的光稳定性以及成像效果，进而实现了其在细胞内脂滴的超分辨成像，具有非常重要的生物学意义。非常重要的生物学意义。非常重要的生物学意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于荧光探针
，具体涉及一种基于激发态质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]具有可控光开关特性的荧光染料是单分子定位显微成像的关键。目前为数不多的超分辨闪烁荧光染料，例如Janelia Fluor(JF 549)，HMSiR(硅
‑
罗丹明)等，严重依赖呫吨及其衍生物，尤其是罗丹明类结构。这些染料通过光激活或可逆热平衡保证其光开关特性。尽管这些已报道的染料有很好的光化学特性和闪烁性能，但是应用于单分子定位超分辨成像新的、结构简单、具有高效闪烁机制的透膜荧光染料十分缺陷。因此，发现新的闪烁机制，制备出生物相容性好、成像条件简单的染料，是拓展单分子定位显微成像技术发展的迫切需求。
[0003]在探索微观世界的过程中，光学显微技术已成为生物医学领域中必不可少的研究工具。然而，传统的光学显微成像技术的分辨率只能止步于200纳米，无法对更小的生物分子和结构进行观察。近年来，超分辨成像作为一种能够突破衍射极限的技术，尤其是单分子定位显微成像(Single Molecule Localization Microscopy,SMLM)技术，利用荧光团显著的闪烁能力来实现纳米级精度的超分辨率成像。目前，用于SMLM成像的染料十分有限。最早使用的Alexa Fluor系列或者花青素类的染料只能在固定细胞中成像，这局限了它们的应用。近年来，罗丹明类染料由于它良好的细胞通透性和优异的光物理性质得到了研究者的青睐，在活细胞的超分辨成像具有更高的时空分辨率。但是这类染料的合成过程十分复杂，并且通常需要额外引入短波长高能量的激光，还需要添加一些成像缓冲液来促进荧光团的闪烁能力。高性能的荧光染料是实现单分子定位超分辨成像的前提。因此，本课题旨在创新专利技术一类不同于罗丹明类染料结构和闪烁机制的新型自发闪烁的荧光染料，以扩大单分子定位超分辨成像染料的荧光团库，为微小尺寸的生物分子和结构的深入研究提供基础，这对于突破超分辨成像染料缺乏的瓶颈具有重要意义。
[0004]脂滴作为细胞内一种新兴的高度动态的细胞器，广泛存在于细菌、植物以及动物细胞中，由含甘油三酯和胆固醇酯的中性内核和表面分布有多种蛋白的磷脂单分子层组成。它们参与多种细胞活动过程，如膜形成、膜运输、脂质代谢与存储、信号转导和蛋白质
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蛋白质相互作用，在保护细胞免受脂毒性、调节细胞能量稳态和脂凋亡过程中起着极其重要的作用。然而，有研究表明，脂质贮存的异常往往会引发多种代谢性疾病，如肥胖症、脂肪肝、心血管疾病和糖尿病等。因此，开发一种能有效检测脂滴形态的分子工具，在脂滴形态学研究和相关疾病的诊断方面皆具有极其重要的参考价值和应用前景。
[0005]因此，利用超分辨荧光成像技术的优异分辨率、灵敏度和选择性，这将被广泛应用于生物成像领域，为亚细胞器结构进一步在超高分辨率下的研究提供了可靠的方法。
[0006]随着强荧光发射、高光稳定性和良好生物相容性的聚集诱导发光(AIE)荧光分子
的发展，越来越多的AIE荧光材料被应用于正常细胞和动物体内的脂滴成像。AIE荧光材料解决了传统的芳香共轭环荧光发色团聚集荧光猝灭问题，与生物背景中不发光或弱发光分子实现区分，而大多数AIE荧光分子聚集时容易发生荧光位移变化，导致此类结构很难对较复杂的生物体系和生命活动过程进行荧光动态监测。具备分子内激发态质子转移效应(ESIPT)的荧光分子往往具有斯托克斯位移大、光稳定性好的特点，并且与AIE效应相结合，进一步提高荧光探针检测的精确性，更有潜力被应用于脂滴的超分辨成像。
[0007]目前，有很多关于荧光材料用于脂滴生物成像的文献报道，商业化的脂滴检测探针主要有BODIPY493/503以及Nile Red等，但这一类传统的有机荧光分子存在一定的缺陷，在脂滴处聚集时易造成荧光强度的衰减甚至猝灭，并且光稳定性较差，从而很难实现对脂滴形态的超高分辨成像。
[0008]因此，亟需构建一种光物理性质优良和生物相容性好的荧光探针以满足脂滴超分辨荧光成像的需求。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法及其在脂滴超分辨荧光生物成像方面的应用，此方法克服了常规脂滴检测材料在脂滴处聚集时易造成荧光强度的衰减甚至淬灭，并且光稳定性较差，难以获得脂滴形态的超高分辨成像等问题。
[0010]为解决上述问题，本专利技术提供以下技术方案：
[0011]本专利技术提供一种基于激发态质子转移的聚集诱导发光材料的制备方法，该材料对于标记脂滴具有更好的光稳定性以及成像效果，其结构由下述通式(A)表示：
[0012][0013]其中，R选自吗啉基或者哌啶基。
[0014]本专利技术提供一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其合成该材料的合成路线如下：
[0015][0016]具体合成步骤如下：
[0017]步骤(1)：中间体1
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甲烷肼基萘
‑2‑
醇的合成：
[0018]以无水乙醇为溶剂，在惰性气氛中，将2
‑
羟基
‑1‑
萘甲醛和水合肼回流反应至完全，分离纯化产物，得到通式(A)所示化合物，；
[0019]步骤(2)：以无水甲醇为溶剂，在惰性气氛中，将所述式(Ⅰ)所示化合物与式(Ⅱ)所示的对位取代苯甲醛在催化量的对甲苯磺酸催化作用下，加热回流反应至完全，分离纯化产物，得到所述式(Ⅲ)所示化合物，ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ，
[0020]其中，R选自吗啉基或者哌啶基。
[0021]本专利技术提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(1)中，2
‑
羟基
‑1‑
萘甲醛与水合肼的摩尔比为1:5～8。
[0022]本专利技术提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(1)中，在每mmol的2
‑
羟基
‑1‑
萘甲醛中加入无水乙醇10
‑
20mL进行稀释。
[0023]本专利技术提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(1)中，回流反应的时间为4
‑
6小时。
[0024]本专利技术提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(2)中，式(Ⅰ)所示化合物与式(Ⅱ)所示的对位取代苯甲醛的摩尔比为1:1.05～1.1。
[0025]本专利技术提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(2)中，在每mmol的式(Ⅰ)所示化合物中加入的对甲苯磺酸摩尔量为所述式(Ⅰ)所示化合物的1～2％mmol。
[0026]本专利技术提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(2)中，在每mmol的式(Ⅰ)所示化合物中加入无水乙醇5...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于该材料对于标记脂滴具有更好的光稳定性以及成像效果，其结构由下述通式(A)表示：其中，R选自吗啉基或者哌啶基。2.如权利要求1所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：以无水乙醇为溶剂，在惰性气氛中，将2
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羟基
‑1‑
萘甲醛和水合肼回流反应至完全，分离纯化产物，得到化合物Ⅰ；步骤(2)：以无水甲醇为溶剂，在惰性气氛中，将所述化合物Ⅰ与对位取代苯甲醛Ⅱ在催化量的对甲苯磺酸催化作用下，加热回流反应至完全，分离纯化产物，得到所述式(A)所示化合物，ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ，其中，R选自吗啉基或者哌啶基。3.如权利要求2所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，2
‑
羟基
‑1‑
萘甲醛与水合肼的摩尔比为1:5～8。4.如权利要求2所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在每mmol的所述2
‑
羟基
‑1‑
萘甲醛中加入无水乙醇10
‑
20mL进行稀释。
5.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凯，吴伟俊，高继，李依明，周露露，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：