本发明专利技术涉及涉及一种分离基因重组蛋白的亲和－膜过滤载体的制法与应用。在超声场中对碱活化的水溶性载体基质进行环氧活化后，与亲和配基偶联，再与金属离子螯合，获得水溶性亲和－膜过滤载体。采用本发明专利技术制备水溶性亲和－膜过滤载体时载体的环氧活化取代度最高可达１．５３７４ｍｍｏｌ／ｇ，金属离子和组氨酸标记间的螯合作用能力强，提高了亲和－膜过滤载体材料对基因重组蛋白的特异性吸附，具有很高的选择性，采用本发明专利技术方法分离带组氨酸标记的基因重组蛋白的回收率达９０％以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛋白质分离材料的制备方法和应用，具体涉及一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法与应用。
技术介绍
基因重组蛋白的应用越来越广泛，重组蛋白的分离在一定程度上限制了其在我国各个领域应用的深度和广度。亲和-膜过滤分离新技术根据目标蛋白的生物化学特性，将亲和配基偶联到水溶性大分子基质上，在溶液状态下亲和载体特异性吸附目标蛋白形成分子团簇，其微粒尺寸远大于其它杂质成分，在膜分离过程中可以实现分子团簇与杂质的高效分离，因此，亲和-膜过滤分离兼具生物亲和的特异性和膜分离的快速、易放大。Mattiasson最初提出了亲和-膜过滤法分离蛋白质的可行性，并成功地利用热致死细菌^cc/2arawwy;c^cw^^^细胞膜上残基作为亲和配基，分离纯化了刀豆蛋白。此后，有关亲和-膜过滤分离蛋白质的研究包括用m-氨基苯甲脒偶联高分子聚合物实现分子量接近的胰岛素和糜蛋白酶的分离；用N-丙烯酰-m-氨基苯甲脒与丙烯酰胺的聚合物分离尿激酶；用生物素化脂质体纯化抗生素蛋白avidin;用偶联染料Cibacron Blue的琼脂糖实现人血清白蛋白与溶菌酶的相互分离；用高取代染料sephmose回收牛血清白蛋白等。由于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的分子量相近，单独运用超滤的方法很难将二者完全分离开来，中国专利ZL200410027191.7应用所合成的可溶性亲和载体，在超滤膜分离体系中通过吸附目标分子、清洗杂蛋白、洗脱目标分子获得纯化的胰蛋白酶。结果表明，用配基为PAB的亲和载体纯化胰蛋白酶，'获得胰蛋白酶纯化倍数达到93倍，回收80%以上。虽然从提出亲和-膜过滤分离技术至今已有20多年，但是，至今未见产业化应用。究其原因，其一，亲和配基仅仅针对某一个或几个特定的蛋白质，难以形成规模化的分离纯化方法；其二，这些亲和配基与目标蛋白间的作用力弱，需要多级膜分离才能达到理想的分离效率；其三，在专利"水溶性亲和超滤载体的制备方法"(专利号ZL200410027191.7)中载体的环氧反应效率低，载体环氧取代度仅0.3mmol/g左右，降低了载体材料的分离效率
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足之处，提供一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法与应用。本专利技术选择水溶性基质材料，偶联与基因重组蛋白中组氨酸标记有强亲和作用的亲和配基和金属离子，制备出亲和-膜过滤分离载体材料，并应用于基因重组蛋白的膜分离纯化，蛋白回收率高。本专利技术目的通过以下技术方案来实现一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法，包括以下步骤(1) 水溶性载体基质的碱活化将水溶性载体基质溶解于碱溶液中，形成混合溶液，其中，水溶性载体基质的重量百分数的2 6%，反应后得到碱活化载体；(2) 碱活化载体的环氧活化向碱活化载体中加入环氧氯丙垸，组成反应体系，将反应体系在超声场中反应2 5h，反应温度为30。C 50。C，得环氧活化载体；G)环氧活化载体与亲和配基的偶联将亲和配体与环氧活化载体溶液以体积比1:1 3:1进行反应，反应温度为30'C 5(TC，反应时间为2 5h，得偶联亚氨基二乙酸的载体；(4)偶联亲和配基的载体与金属离子的耦合将金属离子溶液与偶联亚氨基二乙酸的载体溶液以体积比1:1 3:1进行反应，反应温度为2(TC 4(TC，反应时间为2 4h，得到本专利技术的亲和-膜过滤载体。步骤(1)所述的水溶性载体基质是葡聚糖，其分子量为1500000 3000000。步骤(1)所述的碱溶液包括NaOH或KOH的水溶液，浓度为0.1 0.3mol/L;所述的反应的温度为20 30°C;反应时间为20 40min。步骤(2)所述的环氧氯丙垸占反应体系的体积百分数为2 6%,超声频率为35 130kHz，超声功率为200W 600W。步骤(3)所述的亲和配体包括亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸或N， N， N-三羧甲基乙二胺。步骤(3)所述的亲和配体的浓度为0.1 0.5mol/L，环氧活化载体溶液中载体的重量百分数为2 4%。步骤(4)所述的金属离子溶液中金属离子的浓度为0.1 0.5mol/L，步骤(4)所述的金属离子包括Ci^+、 C(^+或N产，偶联亚氨基二乙酸的载体在偶联亚氨基二乙酸的载体溶液中的重量百分数为2 4%。所述方法制备的亲和-膜过滤载体在分离基因重组蛋白中的应用。本专利技术方法制备的亲和-膜过滤载体分离基因重组蛋白的方法，包括如下步骤将亲和-膜过滤载体溶液与组氨酸标记的基因重组蛋白溶液以体积比为2:1 4:1相混合，其中，亲和-膜过滤载体溶液中，亲和-膜过滤载体占2 4wt%，基因重组蛋白溶液中基因重组蛋白的浓度为1 3mg/mL;混合溶液在温度15 35°C、搅拌速度为100 200r/min下，反应0.5 1.5h，形成亲和-膜分离载体与基因重组蛋白的结合体，应用截留分子量为10万 30万的超滤膜分离截留结合体，在截留的结合体上用与其等体积的0.2 0.5mol/L的咪唑缓冲溶液从载体上洗脱基因重组蛋白，洗涤2 4次，再用截留分子量为10万 30万的超滤膜将基因重组蛋白与亲和-膜分离载体分离。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点和有益效果1、 本专利技术所制备的水溶性亲和-膜过滤分离载体对基因重组蛋白的特异性吸附来自于亲和-膜过滤载体材料的金属离子和基因重组蛋白的组氨酸标记间的螯合作用。因而，本专利技术所制备的亲和-膜过滤载体材料可以实现一类基因工程产物(而不是一个或几个特定蛋白质)的下游分离纯化。2、 金属离子和组氨酸标记间的螯合作用能力强，提高了亲和-膜过滤载体材料对基因重组蛋白的特异性吸附，具有很高的选择性，应用本专利技术方法所制备的水溶性亲和-膜过滤分离载体，蛋白质的回收率达到90%以上。3、 本专利技术采用超声波强化碱活化载体的环氧活化反应，提高了水溶性载体的环氧取代度，载体环氧取代度最高可达1.5374mmol/g，提高了亲和-膜过滤载体材料的吸附能力。具体实施例方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，在实施例中所用的基因重组蛋白为N-末端带有6个组氨酸标记的AxCesD， AxCesD是木醋杆菌UcWo6a"er xW咖w)中纤维素合成因子中的一个蛋白质亚基。但是，本专利技术所制备的水溶性亲和-膜过滤分离载体同样适用于分离其它带组氨酸标记的基因重组蛋白，且本专利技术的实施方式不限于此。实施例1以分子量为150万的葡聚糖为水溶性载体基质，将0.2g水溶性载体基质溶解于浓度为0.3mol/L的NaOH溶液中，形成混合溶液，.水溶性载体基质用量为混合溶液重量的4%，在25'C反应30min，得碱活化载体。向碱活化载体中加入0.3ml环氧氯丙垸，组成反应体系，环氧氯丙烷占反应体系的体积百分数为6%，在超声频率为130kHz、超声功率为300W的超声场中反应3h，反应温度为30°C，获得环氧取代度为1.5374mmol/g的环氧活化载体。将0.5mol/L的亚氨基二乙酸(IDA)溶液与0.2ml的环氧活化载体溶液以体积比1:1 在4(TC反应5h，其中环氧活化载体在环氧活化载体溶液中的重量百分数为4%，得偶联IDA 的载体。将0.5mol/L的CuS04溶液与2ml的偶联IDA的载体溶液以体积比1:1在40'C反应2h， 其中偶联IDA的载体在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离基因重组蛋白的亲和－膜过滤载体的制法，其特征在于，包括以下步骤： （１）水溶性载体基质的碱活化：将水溶性载体基质溶解于碱溶液中，形成混合溶液，其中，水溶性载体基质的重量百分数的２～６％，反应后得到碱活化载体； （２）碱活 化载体的环氧活化：向碱活化载体中加入环氧氯丙烷，组成反应体系，将反应体系在超声场中反应２～５ｈ，反应温度为３０℃～５０℃，得环氧活化载体； （３）环氧活化载体与亲和配基的偶联：将亲和配体与环氧活化载体溶液以体积比１∶１～３∶１进行反应 ，反应温度为３０℃～５０℃，反应时间为２～５ｈ，得偶联亚氨基二乙酸的载体； （４）偶联亲和配基的载体与金属离子的耦合：将金属离子溶液与偶联亚氨基二乙酸的载体溶液以体积比１∶１～３∶１进行反应，反应温度为２０℃～４０℃，反应时间为２～４ ｈ，得到本专利技术的亲和－膜过滤载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡松青，赵玮，李琳，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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