一种规模化培养肝细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种新型的具有肝细胞特异性的丝素－半乳糖基化壳聚糖大孔微载体及其制备方法，以及利用它在微重力旋转培养条件下进行肝细胞培养的方法。本发明专利技术提供的新型微载体与常规的实心支架材料相比具有更大的表面积／体积，且窦隙结构与体内肝窦结构高度相似，因而更有利于肝细胞在支架材料上的黏附、更有利于细胞间的相互接触及氧气、营养成分的传送和代谢产物的排出，从而进一步提高体外肝细胞的培养密度和肝细胞功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，具体涉及利用一种新型的肝 细胞特异性大孔微载体进行肝细胞规模化培养的方法。
技术介绍
生物人工肝于80年代后期开始逐渐发展起来，虽已经历20余年发展， 取得一定的进展，但仍未能广泛而有效地运用于临床，成为完全替代肝脏移 植手术以治疗各种急慢性肝功能衰竭的最佳方法，其中如何实现体外肝细胞 数量多、功能强的规模化培养是目前强烈限制生物人工肝发展的瓶颈问题。肝细胞是锚定依赖性细胞，其功能的有效发挥必须依赖于对支架材料等 支持物的贴附。理想的肝组织工程支架除了应具有无毒、良好的组织细胞相 容性与细胞粘附性能等基本要求外，具有足够的细胞粘附表面积和利于气体 和物质交换的孔隙率亦尤为重要。支架材料的选择是肝脏组织工程中的热点 问题，目前常见的肝组织工程支架材料有壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯树酯、 聚氨酯泡沫等天然或合成的材料。而在众多的体外肝细胞规模培养方法中， 而目前研究表明，多孔微载体作为支架的三维培养正是实现肝细胞规模化培 养的一种有效方法，这种培养模式具有单层培养和悬浮培养两种培养方法的 优点。但在肝细胞培养中，现存的多孔微载体均不够理想，因而寻求一种理 想的具有肝细胞特异性的多孔微载体对目前实现肝细胞体外规模化培养具有 重要意义。謂崎本专利技术的目的之一在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种新型微载体， 具有与常规的实心支架材料相比具有更大的表面积/体积，且窦隙结构与体内 肝窦结构高度相似，因而更有利于肝细胞在支架材料上的黏附、更有利于细 胞间的相互接触及氧气、营养成分的传送和代谢产物的排出，从而进一步提 高体外肝细胞的培养密度和肝细胞功能。本专利技术的另一目的在于提供一种体外规模化培养肝细胞的方法，该方法 结合使用所述新型微载体和微重力旋转培养系统，以实现肝细胞功能强、密 度高的规模化培养。为实现上述目的，本专利技术的一个方面提供一种大孔微载体，其对肝细胞具有高度的亲和性，该大孔微载体的粒度为200-500|Lim，其是由丝素蛋白和 半乳糖基化壳聚糖在交联剂的作用下制得的。在本专利技术的实施反式中，可通过下述方法制备所述大孔微载体，该方法包括(a) 将丝素蛋白溶液与半乳糖基化壳聚糖溶液按比例混合，使得产生终 浓度为4-7 w/W的丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液；(b) 将乳化剂分散进入所述丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液中，得到 白色乳液，并向该白色乳液中缓慢加入交联剂，充分搅拌使水相交联固化；(c) 将步骤(b)中的白色乳液加入搅拌状态的PH为9-10的极性溶剂 中，并继续搅拌40-60分钟，过滤得到互不粘连的微球；(d) 固化所述微球并除去表面的油相，筛滤得到200-500^im的微球；(e) 除去微球中的残留的交联剂，并冷冻干燥，得到所述大孔微载体。 优选地，所述乳化剂为石蜡和/或司班80。所述交联剂优选为戊二醛。所述极性溶剂优选为异丙醇和/或丙酮。在本专利技术的另一个实施方式中，在所述步骤(e)中的冷冻干燥之前还包 括用高浓度蔗糖溶液浸泡所述微球的步骤。在本专利技术的另一个实施方式中，在所述步骤(e)之后还包括消毒步骤。 所述消毒步骤优选为以钴60-Y射线辐照。本专利技术的另一方面提供一种体外大规模培养肝细胞的方法，该方法包括:(c) 提供所述大孔微载体；(d) 将所述大孔微载体用于微重力旋转培养系统中。 在本专利技术的一个实施方式中，在步骤(b)之前还包括用0. lmol/L、 pH为7. 0的无钙镁磷酸镁缓冲液(PBS)浸泡大孔微载体过夜并用含血清培养基 浸泡至少10个小时的步骤。在本专利技术的实施方式中，所述微重力旋转培养系统使用浓縮静止接种法 接种细胞。优选地，所述浓縮静止接种法中的细胞接种量为2X10Vml lX 107ml。优选地，所述浓縮静止接种法中起始培养基量为培养瓶容积的40% 90%。优选地，所述浓縮静止接种法中使用的静止时间为12h 24h。优选地， 所述浓縮静止接种法使用的初始旋转速度为7. 6 9rpm。在优选的实施方式中，所述浓縮静止接种法中使用的培养基的血清浓度 为10% 15%。优选地，所述培养基为DMEN或PRMI 1640;优选地，所述培养 基含有浓度为20 mmol/L 50 ramol/L的HEPES。本专利技术的优点在于利用一种新型的具有肝细胞特异性的丝素-半乳糖基 化壳聚糖大孔微载体在模拟微重力旋转培养条件下进行肝细胞培养，建立了 一种简单的、可靠的体外肝细胞高密度、高分化规模化培养方法，采用该方 法1)可高密度培养肝细胞，丝素-半乳糖基化壳聚糖大孔微载体具有高度类似于体内肝血窦样的窦隙结构，不仅具有特异性肝细胞吸附的作用，为肝细 胞生长提供广大的生长空间，还可实现有效的肝细胞与培养基间营养、氧气和代谢产物的有效流通，实现体外高密度培养， 一般可达107ml; 2)培养肝 细胞功能强，在微重力旋转培养下持续的模拟微重力环境有利于肝细胞增值 分化，有利于细胞与细胞间接触，形成三维结构样组织，进一步增强体外培 养肝细胞功能；3)对肝细胞损伤小，微重力旋转培养采用膜式氧和气体交换， 无气泡与涡流产生，产生的剪切力较小；4)细胞接种效率高，肝细胞是高耗 氧量细胞，特别是在培养起始贴壁期，需氧量最大，且对的剪切力都非常地 敏感；5)通过浓縮接种期细胞与微载体悬液，不仅提高了细胞与微载体的相 对浓度，增加了细胞与微载体间的接触机会，还在旋转培养瓶内产生了气液 平面，縮短了细胞与气液平面的距离，并通过扭开阀门和瓶盖，可与外界(即 孵箱)进行有效的气体交换。因而，该方法更有利于肝细胞在支架材料上的 黏附、更有利于细胞间的相互接触及氧气、营养成分的传送和代谢产物的排 出，从而进一步提高体外肝细胞的培养密度和肝细胞功能。附图说明图1是本专利技术的大孔微载体在倒置显微镜下的图片；图2是本专利技术的大孔微载体在电子显微镜下的图片；图3a是利用本专利技术的丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体静止培养的 CL-1细胞(第六天)在电子显微镜下的图片；图3b是利用本专利技术的丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体微重力培养的 CL-1细胞(第六天)在电子显微镜下的图片；图4是在静止和微重力下丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体培养CL-1细胞的上清尿素浓度；图5a是利用实心微载体(cytodex)微重力培养的CL-1细胞(第六天) 在电子显微镜下的图片；图5b是利用本专利技术的大孔微载体(丝素/半乳糖基化壳聚糖)微重力培 养的CL-l细胞(第六天)在电子显微镜下的图片；图6是在利用图5a和图5b中的载体进行微重力培养的CL-1细胞上清尿 素浓度的比较；图7a是利用多孔微载体(cytodpore)微重力培养的CL-1细胞(第六天) 在电子显微镜下的图片；图7b是利用本专利技术的大孔微载体(丝素/半乳糖基化壳聚糖)微重力培 养的CL-1细胞(第六天)在电子显微镜下的图片；图8是利用图7a和图7b中的载体进行微重力培养的CL-1细胞上清尿素 浓度的比较。具体实施例方式为了更好地理解本专利技术的方法，下面将通过实施例和实验证据进一步阐述本专利技术及其优势。在详细描述以下实施例和实验之前，首先需要定义和澄 清一些术语。丝素蛋白是一种无生理活性的天然结构性蛋白，主要由三种简单的氨基 酸甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，它们在蛋白总量中大概占85%。目前研 究本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大孔微载体，其粒度为２００－５００μｍ，由丝素蛋白和半乳糖基化壳聚糖在交联剂的作用下制得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周焕城，张志，高毅，龚独辉，蒋泽生，刘勇，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]