本发明专利技术提供了一种同时检测甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒及甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法及试剂盒。本发明专利技术所述的甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法，包括以下步骤：１）病毒ＲＮＡ的提取；２）荧光定量ＰＣＲ检测；３）检测结果判断。通过序列多重比对，针对甲型流感病毒及甲型Ｈ１Ｎ１（２００９年流行）流感病毒的保守基因片段，设计出特异性强的引物和探针，用于实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测。本发明专利技术可用于检测甲型人流感、猪流感、禽流感等流感病毒ＲＮＡ，同时可以特异地检测甲型Ｈ１Ｎ１（２００９年流行）流感病毒ＲＮＡ，进行双重分析使检测结果更加可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种同时检测甲型及甲型Hmi流感病毒的实时 荧光检测方法及试剂盒。
技术介绍
流行性感冒简称流感，是由甲型、乙型、丙型三种流感病毒引起的急性呼吸道传染 病。根据其表面结构(血凝素H和神经氨酸酶N)及其基因特性的不同，甲型流感病毒又可 分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶9个 亚型(N1-N9)。甲型Hmi流感病毒是其中的一种亚型，它引起甲型Hmi流感。2009年从墨西哥爆发并蔓延到全球多个国家的人感染甲型Hmi流感疫情，是由 于一种新变异的甲型Hmi流感病毒引发的，被世界卫生组织称为“国际关注的突发公共卫 生事件”，已达到了最高的6级警告标准。引起本次甲型Hmi流感的流感病毒的毒株包含有猪流感、禽流感和人流感等三 种流感病毒的基因片段(余健民.甲型Hmi流感的诊治与预防.江西医药，2009，44 (4))。 本次甲型Hmi流感具有以下几个特点一是此次疫情由新的流感病毒变异株引起，人群普 遍易感，已引起跨国、跨洲传播。二是出现了人传人病例。三是墨西哥已经出现了较多的重 症和死亡病例。四是流感病人在发病前一天已可排毒，有些人感染后不发病，但仍然具有传 染性，隐性传染比例相当高。今年流行的甲型Hmi病毒已经蔓延到世界许多国家，不足一个月，全球确诊的甲 型Hmi流感病例已突破万例，我国也出现了多例输入性流感病例。给人类生命安全造成了 一定危害，包括我国政府在内的世界各国都采取了积极有效的防控措施，以防止疾病的迅 速蔓延。面对突然爆发的流行性疾病，开展对疾病预防、诊断、致病机理以及治疗研究是相 关领域关注和研究的重点。荧光定量PCR具有灵敏、准确、实时的技术优点，通过针对当前流行的甲型Hmi和 甲型流感病毒，设计不同的引物和探针，组装成荧光定量PCR试剂盒，迅速准确检测甲型流 感病毒及当前流行的甲型Hmi流感病毒，以便开展早期大规模筛查及有效地控制疾病的 迅速传播。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种甲型Hmi流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时 荧光检测方法以及相应的试剂盒，采用两种探针同时检测甲型Hmi流感病毒(2009年流行 的新变种)和甲型流感病毒，通过双重验证使结果更加稳定；同时也可以区分甲型流感病 毒及其他病毒，以及区分甲型Hmi流感病毒(2009年流行的新变种)及其他普通流感病 本专利技术所述的一种甲型Hmi流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方4法，包括以下步骤1)病毒RNA的提取a)从已灭活的病毒培养液中取200-400ul病毒样本加入0. 5ml Trizol，反复震 荡，抽吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分钟；b)在病毒裂解液中加入0. Iml的氯仿并震荡至乳糜化，20-37°C下孵化10分钟， 40C 12000rpm下离心15分钟，取上清液；c)在上清液中加入0. Iml的异丙醇，20-37°C下孵化10分钟，4°C 12000rpm下离心15分钟，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0. 5ml的75%乙醇洗涤沉淀，4°C 7500rpm下离心5分钟，除尽上清液，使 沉淀干燥，该沉淀为病毒样本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20 μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)荧光定量PCR检测采用50 μ 1的荧光定量PCR反应体系；甲型Hmi流感病毒检测体系包含甲型Hmi流感病毒RT-PCR反应液29 μ 1，酶混合液2μ1，ROX 校正液Ιμ ，RNA 提取液4μ1;甲型流感病毒检测体系包含 甲型流感病毒RT-PCR反应液29 μ 1，酶混合液2μ1，ROX 校正液Ιμ ，RNA 提取液4 μ 1 ；实时荧光定量RT-PCR反应程序反转录42 °C 5分钟，反转录酶灭活95 °C 10秒，40 个循环 95°C 5 秒，60°C 31 秒；所述的甲型Hmi流感病毒RT-PCR反应液包含RT-PCR 缓冲液；一对甲型Hmi流感病毒特异引物，上游引物的序列为SEQ ID NO. 1，下游引物的序 列为SEQ ID NO. 2以及一条甲型Hmi流感病毒TaqMan荧光探针，序列为SEQ ID NO. 3，其中，5，端的荧 光基团为FAM(6-羧基荧光素)，3’端的淬灭剂为TAMARA (6-羧基四甲基若丹明)；所述的甲型流感病毒RT-PCR反应液包含RT-PCR 缓冲液；—对甲型流感病毒特异引物，上游引物的序列为SEQ ID NO. 4，下游引物的序列为 SEQ ID N0. 5 以及一条甲型流感病毒TaqMan荧光探针，序列为SEQ ID N0. 6，其中，5，端的荧光基团 为FAM(6-羧基荧光素)，3’端的淬灭剂为TAMARA (6-羧基四甲基若丹明)；5所述的酶混合液，由Taq酶5U/ μ 1和逆转录酶5U/ μ 1以体积比1 1混合组成；3)检测结果判断荧光定量RT-PCR程序结束后，仪器已自动记录保存每个循环的荧光信号，进行阈 值调整后，通过检测甲型Hmi和甲型流感病毒的扩增曲线及ct值进行结果判断。本专利技术的另一目的在于提供了一种甲型Hmi流感病毒与甲型流感病毒联合核酸 实时荧光检测的试剂盒。本专利技术所述的一种甲型流感病毒与甲型Hmi流感病毒联合核酸实时荧光检测的 试剂盒，包括ROX校正液、焦碳酸二乙酯水、阴性对照、甲型阳性对照、甲型Hmi阳性对照， 其特征在于，还包括以下成分甲型Hmi流感病毒RT-PCR反应液，包含RT-PCR 缓冲液；一对甲型Hmi流感病毒特异引物，上游引物的序列为SEQ ID NO. 1，下游引物的序 列为SEQ ID NO. 2 ；以及一条甲型Hmi流感病毒TaqMan荧光探针，序列为SEQ ID NO. 3，其中，5，端的荧 光基团为FAM(6-羧基荧光素)，3’端的淬灭剂为TAMARA (6-羧基四甲基若丹明)；以及甲型流感病毒RT-PCR反应液，包含RT-PCR 缓冲液；一对甲型流感病毒特异引物，上游引物的序列为SEQ ID NO. 4，下游引物的序列为 SEQ ID NO. 5 ；以及一条甲型流感病毒TaqMan荧光探针，序列为SEQ ID N0. 6，其中，5’端的荧光基团 为FAM(6-羧基荧光素)，3’端的淬灭剂为TAMARA (6-羧基四甲基若丹明)；以及酶混合液，由Taq酶5U/ μ 1和逆转录酶5U/ μ 1以体积比1 1混合组成。本专利技术的特点和优点在于在甲型流感病毒及当前流行的甲型Hmi序列分析的 基础上，选取甲型流感病毒及当前流行的甲型Hmi流感病毒的保守基因片段，应用primer Express软件设计引物和探针；采用改良的Trizol法提取流感病毒RNA，同时，利用实时荧 光定量RT-PCR技术对流感病毒进行检测。在核酸提取结束后直接将核酸加入到RT-PCR反 应液中，cDNA的合成与PCR反应在同一管中进行，不用增加额外的步骤。本专利技术所述得检测 方法和试剂盒在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅缩短了操作时间、降低了劳动强度， 而且也直接降低了检测的成本。本专利技术可用于检测甲型人流感、猪流感、禽流感等流感病毒 RNA,同时可以特异地检测甲型Hmi (2009流行)流感病毒RNA，进行双重分析使检测结果更 力口可靠。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤： １）病毒ＲＮＡ的提取： ａ）从已灭活的病毒培养液中取２００－４００ｕｌ病毒样本加０．５ｍｌ Ｔｒｉｚｏｌ，反复震荡，抽吸以利于病毒裂解，２０－３７℃下孵化５分钟； ｂ）在病毒裂解液中加入０．１ｍｌ的氯仿并震荡至乳糜化，２０－３７℃下孵化１０分钟，４℃１２０００ｒｐｍ下离心１５分钟，取上清液； ｃ）在上清液中加入０．１ｍｌ的异丙醇，２０－３７℃下孵化１０分钟，４℃１２０００ｒｐｍ下离心１５分钟，去掉上清液，使沉淀干燥； ｄ）加入０．５ｍｌ的７５％乙醇洗涤沉淀，４℃７５００ｒｐｍ下离心５分钟，除尽上清液，使沉淀干燥，该沉淀为病毒样本的ＲＮＡ； ｅ）用焦碳酸二乙酯水２０μｌ溶解ＲＮＡ沉淀，ＲＮＡ溶液于－８０℃下保存； ２）荧光定量ＰＣＲ检测： 采用５０μｌ的荧光定量ＰＣＲ反应体系； 甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒检测体系包含： 甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒ＲＴ－ＰＣＲ反应液 ２９μｌ， 酶混合液 ２μｌ， ＲＯＸ校正液 １μｌ， ＲＮＡ提取液 ４μｌ；甲型流感病毒检测体系包含： 甲型流感病毒ＲＴ－ＰＣＲ反应液 ２９μｌ， 酶混合液 ２μｌ， ＲＯＸ校正液 １μｌ， ＲＮＡ提取液 ４μｌ； 实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ反应程序： 反转录 ４２℃５分钟， 反转录酶灭活 ９５℃１０秒， ４０个循环 ９５℃５秒，６０℃３１秒； 所述的甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒ＲＴ－ＰＣＲ反应液包含： ＲＴ－ＰＣＲ缓冲液； 一对甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒特异引物，上游引物的序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１，下游引物的序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２；以及 一条甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒ＴａｑＭａｎ荧光探针，序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３，其中，５’端的荧光基团为６－羧基荧光素，３’端的淬灭剂为６－羧基四甲基若丹明； 所述的甲型流感病毒ＲＴ－ＰＣＲ反应液包含： ＲＴ－ＰＣＲ缓冲液； 一对甲型流感病毒特异引物，上游引物的序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４，下游引物的序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５；以及 一条甲型流感病毒ＴａｑＭａｎ荧光探针，序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６，其中，５’端的荧光基团为６－羧基荧光素，３’端的淬灭剂为６－羧基四甲基若丹明； 所述的酶混合液，由Ｔａｑ酶５Ｕ／μｌ和逆转录酶５Ｕ／μｌ以体积比１∶１混合组成； ３）检测结果判断： 荧...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾令文，顿博影，刘杰，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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