小花山柰提取物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了提取物制备技术领域的小花山柰提取物的制备方法及其应用，包括以下步骤：S1.小花山柰根状茎提取物的制备，S1

【技术实现步骤摘要】
小花山柰提取物的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于提取物制备
，具体是小花山柰提取物的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]小花山柰又名泰国黑姜、泰国人参、烂姜等，为姜科，山柰属多年生草本植物，原产于缅甸、马来西亚、印度尼西亚的苏门答腊岛和婆罗洲岛等，广泛分布于东南亚热带及亚热带地区。姜科植物作为亚热带植物物种最丰富的类群之一，是姜目中最具特色的一个类群，是具有较高经济价值的林下经济植物。小花山柰作为传统药物具有悠久的应用历史，小花山柰叶中含有的原花青素，可用于食品和化妆品开发；小花山柰根茎含有多种黄酮类物质，具有抗疟原虫和抗真菌的活性；小花山柰的代谢产物被证实具有抗过敏、抗细菌、抗胃溃疡和抗癌细胞等多种对人类有益的生物活性。
[0003]杜英，别名假杨梅、梅擦饭、青果、野橄榄、胆八树、橄榄、缘瓣杜英。杜英科杜英属常绿乔木，高可达15米，叶革质，披针形或倒披针形，边缘有小钝齿；叶柄初时有微毛，在结实时变秃净。总状花序多生于叶腋，花序轴纤细，花白色，萼片披针形，花瓣倒卵形，花药顶端无附属物；核果椭圆形，外果皮无毛，内果皮坚骨质，花期6
‑
7月。杜英常绿速生树种，材质好，适应性强，病虫害少。是庭院观赏和四旁绿化的优良品种。
[0004]其中，杜英生假隐丛赤壳是近年来引起杜英大量死亡的杜英疫病的主要病原菌，现有技术中，通常使用喷洒农药的方法对杜英生假隐丛赤壳进行抑制，但是，抑制效果并不理想；因此，有必要提出一种小花山柰提取物的制备方法及其应用。

技术实现思路
r/>[0005]为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供可以通过小花山柰提取物对杜英生假隐丛赤壳进行抑制的一种小花山柰提取物的制备方法及其应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：小花山柰提取物的制备方法及其应用，包括以下步骤：
[0007]S1.小花山柰根状茎提取物的制备，制备步骤如下：
[0008]S1
‑
1：称取500g洗净晾干的小花山柰根状茎，将其粉碎后放入1000ml玻璃容器内；
[0009]S1
‑
2：向玻璃容器内加入800ml甲醇，在室温下冷浸提取7d后过滤，并使用旋转蒸发仪浓缩过滤液，重复提取3
‑
5次浓缩得到小花山柰根状茎甲醇提取物；
[0010]S1
‑
3：向浓缩后的甲醇提取物内加入500ml水，将甲醇提取物与水混匀，混匀后用等体积的石油醚萃取3
‑
5次，萃取完全后，再用等体积的乙酸乙酯萃取，最后用等体积的正丁醇萃取，分别浓缩萃取液即得石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层提取物，4℃冷藏备用；
[0011]S2.小花山柰根状茎提取物抗细菌活性的测定；S3.小花山柰根状茎提取物抗真菌活性的测定；S4.小花山柰根状茎提取物的细胞毒性测定；S5.小花山柰根状茎提取物的高效液相色谱分析。
[0012]进一步，S2中，小花山柰根状茎提取物抗细菌活性的测定步骤如下：
[0013]S2
‑
1.在28℃，黑暗条件下，用LB平板对供试细菌进行活化培养48h，并挑取单菌落；
[0014]S2
‑
2.在28℃，150rpm，黑暗条件下，用LB液体培养基摇培24h，将菌液浓度稀释到108cfu
·
mL
‑1备用；
[0015]S2
‑
3.用移液枪吸取50μL菌液，用玻璃棒对菌液进行涂板；
[0016]S2
‑
4.用灭完菌的打孔器在涂有细菌的培养基平板上均匀打出直径为6mm的三个孔，在每个孔中分别加入40μL的供试细菌，在黑暗条件下培养24h后，用尺子测量抑菌圈大小，其中，阳性对照为5μL，0.2mg
·
mL
‑1的硫酸链霉素，每个处理重复3次；其中，供试细菌包括桉树青枯病菌、根癌农杆菌、番茄疮痂病菌、黄瓜角斑病菌、溶血葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
[0017]进一步，S3中，小花山柰根状茎提取物抗真菌活性的测定步骤如下：
[0018]S3
‑
1:称取三种不同的杀菌剂各240mg，分别向杀菌剂中加入0.3mL的DMSO，待杀菌剂与DMSO完全溶解后加入0.7mL的无菌水；
[0019]S3
‑
2:采用倍半稀释法，将30％的DMSO再次加入到杀菌剂中，将杀菌剂依次稀释成8个不同的浓度；
[0020]S3
‑
3:将配制好的8个不同浓度的杀菌剂各取1mL分别加到29mL的PDA中，充分混匀后倒入3个无菌培养皿中，每皿为10mL，得到杀菌剂终浓度分别为8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL和0.125mg/mL的含药培养基，且每浓度梯度3个平行；
[0021]S3
‑
4:将配制好的8个不同浓度的杀菌剂分别取1mL加到29mL的PDA中，充分混匀后倒入3个无菌的培养皿中，每皿为10mL，得到杀菌剂的终浓度分别为0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL和0.00625mg/mL的含药培养基；
[0022]S3
‑
5:用打孔器将培养5d且生长良好的供试真菌沿其边缘打成直径为7mm的菌饼，菌饼朝下接种在含药PDA平板上；将加入无菌水的PDA平板作为空白对照，将加入30％DMSO的PDA平板作为阴性对照，将加入98.4％多菌灵的PDA平板作为阳性对照，每个处理重复3次；
[0023]S3
‑
6:将配置好的培养基置于28℃温度下培养5d，待空白对照组的菌落生长至占培养皿面积的2/3时，采用十字交叉法测得不同处理情况下的菌落直径并计算抑菌率；抑菌率的计算公式如下：
[0024][0025]其中，供试真菌包括杜英生假隐丛赤壳和油茶炭疽病菌。
[0026]进一步，S4中，小花山柰根状茎提取物的细胞毒性测定步骤如下：
[0027]S4
‑
1：将各供试样品分别配制成浓度为50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL的样品溶液，将成纤维细胞和人舌鳞癌细胞悬液接种到96孔板上，在37℃、CO2为5％的细胞培养箱中孵育24小时；
[0028]S4
‑
2：每孔加入15μLCCK
‑
8试剂，在37℃、CO2为5％条件下继续培养24h后，采用多功能微孔板检测仪在450nm下检测各孔的吸光度，其中，将不加样品的孔板作为空白对照。
[0029]进一步，S5中，小花山柰根状茎提取物的高效液相色谱分析步骤如下：
[0030]S5
‑
1.称取10mg小花山柰不同提取物，用1mL色谱甲醇对小花山柰提取物进行溶
解；
[0031本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.小花山柰提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.小花山柰根状茎提取物的制备，制备步骤如下：S1
‑
1：称取500g洗净晾干的小花山柰根状茎，将其粉碎后放入1000ml玻璃容器内；S1
‑
2：向玻璃容器内加入800ml甲醇，在室温下冷浸提取7d后过滤，并使用旋转蒸发仪浓缩过滤液，重复提取3
‑
5次浓缩得到小花山柰根状茎甲醇提取物；S1
‑
3：向浓缩后的甲醇提取物内加入500ml水，将甲醇提取物与水混匀，混匀后用等体积的石油醚萃取3
‑
5次，萃取完全后，再用等体积的乙酸乙酯萃取，最后用等体积的正丁醇萃取，分别浓缩萃取液即得石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层提取物，4℃冷藏备用；S2.小花山柰根状茎提取物抗细菌活性的测定；S3.小花山柰根状茎提取物抗真菌活性的测定；S4.小花山柰根状茎提取物的细胞毒性测定；S5.小花山柰根状茎提取物的高效液相色谱分析。2.根据权利要求1所述的小花山柰提取物的制备方法，其特征在于：S2中，小花山柰根状茎提取物抗细菌活性的测定步骤如下：S2
‑
1.在28℃，黑暗条件下，用LB平板对供试细菌进行活化培养48h，并挑取单菌落；S2
‑
2.在28℃，150rpm，黑暗条件下，用LB液体培养基摇培24h，将菌液浓度稀释到108cfu
·
mL
‑1备用；S2
‑
3.用移液枪吸取50μL菌液，用玻璃棒对菌液进行涂板；S2
‑
4.用灭完菌的打孔器在涂有细菌的培养基平板上均匀打出直径为6mm的三个孔，在每个孔中分别加入40μL的供试细菌，在黑暗条件下培养24h后，用尺子测量抑菌圈大小，其中，阳性对照为5μL，0.2mg
·
mL
‑1的硫酸链霉素，每个处理重复3次；其中，供试细菌包括桉树青枯病菌、根癌农杆菌、番茄疮痂病菌、黄瓜角斑病菌、溶血葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。3.根据权利要求2所述的小花山柰提取物的制备方法，其特征在于：S3中，小花山柰根状茎提取物抗真菌活性的测定步骤如下：S3
‑
1:称取三种不同的杀菌剂各240mg，分别向杀菌剂中加入0.3mL的DMSO，待杀菌剂与DMSO完全溶解后加入0.7mL的无菌水；S3
‑
2:采用倍半稀释法，将30％的DMSO再次加入到杀菌剂中，将杀菌剂依次稀释成8个不同的浓度；S3
‑
3:将配制好的8个不同浓度的杀菌剂各取1mL分别加到29mL的PDA中，充分混匀后倒入3个无菌培养皿中，每皿为10mL，得到杀菌剂终浓度分别为8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL、2...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯莹，单体江，仇思润，王张豪，何宇豪，毛子翎，胡淑仪，殷爱华，杜冰，李逸彤，李亭潞，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：