一种检测微量白蛋白的方法技术

本发明专利技术提供一种检测纳克级含量的白蛋白的方法，该方法包括将白蛋白标准品稀释至在纳克级别内适当分布的浓度梯度，加入过量的白蛋白抗体，并进行第一次温育；向温育后的液体中加入相对于剩余白蛋白抗体是过量的放射性同位素标记的白蛋白，并进行第二次温育以使得一部分放射性同位素标记的白蛋白与白蛋白抗体结合为复合物；分离所述复合物并测定复合物的放射性计数；根据放射性计数及相应的标准品中白蛋白的浓度确定两者之间的关系式；以待测样品代替白蛋白标准品重复步骤，根据对待测样品所测得的放射性计数和所述关系式确定待测样品中白蛋白的浓度。该方法能够检测出纳克级含量的白蛋白，且准确率高，稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，具体涉及检测含量为纳克级的白 蛋白的方法。
技术介绍
白蛋白放射免疫分析法是用于测定人尿或体液中白蛋白含量的一种放射 免疫技术，其原理是待测样品、标准品中的白蛋白和1251-白蛋白与有限量的 抗体竞争结合，1251-白蛋白一部分与抗体结合为复合物，另一部分游离；离心 使复合物部分与游离部分分离，取沉淀物并测定其放射性计数；待测样品和 标准品中的白蛋白含量与复合物的放射性强度呈负相关，用一系列不同浓度 的白蛋白做标准，可获得标准曲线，从标准曲线上可查出样品中白蛋白含量。 目前市场上出售的白蛋白放射免疫分析药盒主要用于测定人尿中白蛋白含 量，该药盒测定白蛋白含量的使用方法的一个例子如下(1) 用蒸馏水将白蛋白标准品稀释为lpg/ml、 2ng/ml、 5昭/ml、 10昭/ml、 20^ig/ml和5(Vg/ml，各取100 |nl，记为标准管B。 B2、 B3、 B4、 Bs和B6;(2) 设非特异管和零标管，记为NSB和Bo，分别加入温育液300 Jul和 100 |ul;(3) 取待检测样品各100 ^d，记为样品管S, Sn (N=l);(4) 在Bo、 B, B6和S广Sn管中各加白蛋白抗体200)li1;(5) 取一空白管，记为T管；(6) 在T、 NSB、 B0、 B, B6和S! Sn管中各加"I-白蛋白100|ul，充 分摇匀，37'C温育0.5小时；(7) 在NSB、 Bo、 Bt B6和S广Sn管中各加分离试剂500^1,充分摇 匀后室温静置15分钟，3500转/分离心20分钟；(8) 弃去上清，在r-计数仪上测定各管计数60秒，最后按公式 B/BO%={/^100%进行计算以标 准管的计数结果代入公式中的A计算，得出标准管的B/B。。/。值；以样品管的 计数结果代入公式中的A计算，得出样品管的B/B^/。值；(9) 以标准管的B/B^/。值为纵坐标，以标准管的白蛋白浓度为横坐标， 在半对数纸上绘制标准曲线，样品白蛋白的浓度可根据样品管的B/B,/。值从 标准曲线上査得。上述方法的检测范围为lng/ml 5(Hig/ml，若样品的白蛋白含量超出 5(Htg/ml，可将样品稀释后再重复步骤(1) (9)，然后将从标准曲线中査得 的结果乘以稀释倍数即可。该方法具有稳定性好、准确性及特异性高的优点， 但是其灵敏度较差，仅能检测到微克级别的白蛋白，对于含量更低的白蛋白， 例如体外培养肝细胞合成的纳克级别的微量人白蛋白，则无法检测出。而且 专利技术人发现，即使将标准品溶液的浓度调低至纳克级别以制作标准曲线，也 无法实现纳克级别的白蛋白的准确检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提高白蛋白放射免疫分析法的灵敏度，使其 能够检测出含量在纳克级别的白蛋白。为解决该问题，本专利技术提供，该方法包括以下步骤(a) 将白蛋白标准品稀释至在纳克级别内适当分布的浓度梯度，加入过 量的白蛋白抗体，并进行第一次温育以使它们充分反应；(b) 向温育后的液体中加入相对于剩余白蛋白抗体是过量的放射性同位 素标记的白蛋白，并进行第二次温育以使得一部分放射性同位素标记的白蛋 白与白蛋白抗体结合为复合物，而另一部分放射性同位素标记的白蛋白为游 离状态；(c) 分离所述复合物和游离状态的放射性同位素标记的白蛋白，并测定 复合物的放射性计数；(d) 根据放射性计数及相应的标准品中白蛋白的浓度确定两者之间的关系式；(e) 以待测样品代替白蛋白标准品重复步骤(a)-(c)，根据对待测样品所测 得的放射性计数和所述关系式确定待测样品中白蛋白的浓度。在本专利技术的优选实施方式中，步骤(a)中白蛋白标准品的所述浓度梯度 为2ng/ml、 10ng/ml、 20 ng/ml、 50 ng/ml、 100 ng/ml和200 ng/ml。在本专利技术的优选实施方式中，步骤(a)中所述的第一次温育在37°C 38°C 的温度下持续4 6个小时。在本专利技术的优选实施方式中，步骤(b)中所述的放射性同位素为3H、 1251 或1311。在本专利技术的优选实施方式中，步骤(b)中所述的第二次温育在37°C 38-C的温度下持续12 14个小时。在本专利技术的一个实施方式中，步骤(b)中所述的待测样品来自体外培养 的肝细胞的上清液。在本专利技术的方法中，待测样品中的白蛋白和标准品中的白蛋白首先与白 蛋白抗体充分结合，再加入放射性同位素(例如1251)标记的白蛋白使其与剩 余的抗体结合， 一部分放射性同位素标记的白蛋白与抗体结合为复合物，另一部分游离；加入分离试剂并离心，使得复合物部分与游离部分分离，取沉 淀物并测定其放射性计数；待测样品和标准品中的白蛋白含量与复合物的放 射性强度呈负相关，用一系列不同浓度的白蛋白做标准，可获得标准曲线， 从标准曲线上可査出样品中白蛋白含量。本专利技术方法实现了纳克级别白蛋白含量测定，满足了测定体外培养肝细 胞合成的微量人白蛋白的需要；本专利技术的方法对试剂进行了稀释，减少了试 剂尤其是同位素标记的白蛋白的用量，从而减少了放射性物质对环境的污染。附图说明图1为根据本专利技术的一个实施方式绘制的标准曲线图。 具体实施例方式为了更好地理解本专利技术的方法，下面将通过实施例和实验证据进一步阐 述本专利技术及其优势。在详细描述以下实施例和实验之前，首先需要定义和澄 清一些术语。本文所述的"放射免疫分析法"是指使用以放射性同位素作标记的抗原 或抗体来测定抗体或抗原量的技术。例如，以未知量的无标记抗原(被检物)， 加于已知量的标记抗原和抗体的反应系时，依靠测定无标记抗原对标记抗原 同抗体结合的竞争性抑制达到如何程度，从而可以测定被检物的数量。由于 灵敏度非常敏锐，所以用一般方法难于测定的微量(如微克级别)物质可用此法进行测定。本文所述的"白蛋白标准品"是指在合理的贮存条件下具有稳定性的、 含量准确的、高度纯化的白蛋白。它是放射免疫分析法定量的基准，由于以 标准品的量来表示被测物质的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并 具有相同免疫活性。按实验要求，可用缓冲液将标准品稀释成不同浓度的溶 液，用于制作标准曲线。在本专利技术中，使用蒸馏水来稀释白蛋白标准品。本 专利技术使用的白蛋白标准品可从北京原子高科股份有限公司购买白蛋白放射免 疫分析药盒中得到。本文所述的"纳克级别"是指几纳克至几百纳克的范围，如2纳克、20 纳克、200纳克或500纳克，但不超过1000纳克。对于本文所述的"在纳克 级别内适当分布的浓度梯度"，本领域技术人员根据已有的知识和实际需要可 以很容易地确定合适的浓度梯度分布。本文所述的"温育"可在温育箱、电热恒温水浴锅或其他能够长时间保持 恒温的仪器中进行。本文所述的"放射性同位素"可以是SH、 1251、 1311等。311可以置换有机 化合物中的氢而不影响原有化学性质，且半衰期长、能量低，便于防护；1251 和1311原子的化学性质比较活泼，标记方法简便，可用于多肽、蛋白质与小分 子半抗原的标记。 一些不能直接用碘标记的半抗原，通过接上一个酪氨酸亦 可用碘标记。在本文中优选使用1251对白蛋白进行标记。本专利技术中使用的1251-白蛋白可从北京原子高科股份有限公司购买白蛋白放射免疫分析药盒中得 到。本文所述的"分离试剂"可从北京原子高科股本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测微量白蛋白的方法，该方法包括以下步骤：　（ａ）将白蛋白标准品稀释至在纳克级别内适当分布的浓度梯度，加入过量的白蛋白抗体，并进行第一次温育以使它们充分反应；　（ｂ）向温育后的液体中加入相对于剩余白蛋白抗体是过量的放射性同位 素标记的白蛋白，并进行第二次温育以使得一部分放射性同位素标记的白蛋白与白蛋白抗体结合为复合物，而另一部分放射性同位素标记的白蛋白为游离状态；　（ｃ）分离所述复合物和游离状态的放射性同位素标记的白蛋白，并测定复合物的放射性计数；　 （ｄ）根据放射性计数及相应的标准品中白蛋白的浓度确定两者之间的关系式；　（ｅ）以待测样品代替白蛋白标准品重复步骤（ａ）－（ｃ），根据对待测样品所测得的放射性计数和所述关系式确定待测样品中白蛋白的浓度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李治国，高毅，汪艳，刘金华，杜江，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]