一种纯化HER2单链抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种纯化HER2单链抗体(scFv)的方法，所述方法通过SPY Cather蛋白与SPY Tag多肽间的特异性结合，经过PT Linker

【技术实现步骤摘要】
一种纯化HER2单链抗体的方法


[0001]本专利技术属于蛋白表达
，具体涉及一种快速的纯化HER2单链抗体(HER2
‑
scfv)的方法。

技术介绍

[0002]乳腺癌目前已成为女性诊断和死亡率高的恶性肿瘤。其中大约25
‑
30％的乳腺癌患者存在人类表皮生长因子受体(HER2)过度表达，近年来随着靶向治疗的发展，针对HER2为治疗靶点的抗体偶联药物已成为当下的研究热点。
[0003]单链抗体(scFv)相对分子质量小，更容易穿透组织到达靶部位，使肿瘤周围达到有效的血药浓度；由于缺少Fc段，scFv并不具备完整抗体的效应功能从而导致免疫原性降低，不易引起人体排斥和超敏反应；scFv在体内清除速度快，减少了全抗分子带来的心脏、肝、肾等重要器官的损伤。因此，scFv逐渐成为了基因工程抗体的研究热点之一。
[0004]蛋白质内含肽(intein)是前体未成熟蛋白质中的一段多肽链，可通过蛋白质自我剪接作用实现蛋白质结构的重新排列。Mxe GryA是蟾分枝杆菌Mycobacterium xenopi GryA中198Aa组成的微小型内含肽，将其C端剪接结构模块中的天冬氨酸突变为丙氨酸后可阻断内含肽C端的剪接反应，但在其N末端半胱氨酸处仍然可发生N
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S酰基重排形成硫酯键，可通过添加硫醇试剂如二硫苏糖醇(DTT)来控制硫酯键的断裂。
[0005]SPY Cather与SPY Tag是来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的纤连结合蛋白(FbaB)第二个免疫球样胶原黏附蛋白结构域(CnaB2)的两个可通过异肽键结合的蛋白。SPY Cather与SPY Tag可以在各种不同的条件下(pH、温度、缓冲液组分)可迅速形成稳固的异肽键且不容易发生断裂。
[0006]单链抗体因与质粒、标签构建简便且在重组质粒可在大肠杆菌中成功表达，有利于发挥其免疫诊断、治疗作用。大肠杆菌作为传统生物学表达系统之一，易于培养、遗传背景清晰是表达外原蛋白的首选表达系统。但目前单链抗体在表达纯化方面仍然存在上清表达量较低、沉淀表达操作复杂、纯化步骤繁琐等问题。实现单链抗体的可溶性表达、简化蛋白纯化过程，对后续单链抗体的研究及治疗具有重要意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供了一种一步法纯化单链抗体的方式，所述方法通过SPY Cather与SPY Tag之间的特异性捕获scFv，再利用二硫苏糖醇(DTT)使Mxe GyrA内含肽发生N端断裂纯化scFv，从而实现无需仪器与纯化柱的一步分离纯化单链抗体的新方法。
[0008]本专利技术的目的可通过以下技术实现。
[0009]本专利技术的的第一个方面，提供了一种用于修饰环氧载体的PT Linker
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SPY Cather重组蛋白，所述重组蛋白由多肽片段PT Linker和SPY Cather蛋白组成，所述PT Linker
‑
SPY Cather重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术的的第二个方面，提供了一种scFv
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Mxe GyrA
‑
SPY Tag重组蛋白，所述重组
蛋白由单链抗体(scFv)、内含肽(Mxe GyrA)及多肽片段SPY Tag组成，所述scFv
‑
Mxe GyrA
‑
EGFP
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SPY Tag重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]本专利技术的的第三个方面，供了一种纯化HER2单链抗体(scFv)的方法，包括如下
[0012]步骤：
[0013]1)将PT Linker
‑
SPY Cather基因序列插入到表达载体的多克隆位点构建重组表达质粒，并在大肠杆菌中成功表达PT Linker
‑
SPY Cather重组蛋白，纯化得到该重组蛋白，将PT Linker
‑
SPY Cather重组蛋白与环氧载体LX
‑
1000EP在室温下孵育，得到PT Linker
‑
SPY Cather
‑
LX1000EP环氧载体；
[0014]2)将scFv
‑
Mxe GyrA
‑
EGFP
‑
SPY Tag重组蛋白的融合基因核苷酸编码序列插入到表达载体的多克隆位点构建重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达，获得scFv
‑
Mxe GyrA
‑
EGFP
‑
SPY Tag重组蛋白，
[0015]3)将步骤(1)中得到的PT Linker
‑
SPY Cather
‑
LX1000EP环氧载体吸附细胞裂解上清中的scFv
‑
Mxe GyrA
‑
EGFP
‑
SPY Tag重组蛋白；
[0016]4)除去未吸附的杂蛋白，加入DTT的磷酸盐缓冲液将被吸附的scFv洗脱下来。
[0017]在其中的一些实施例中，步骤3)中的吸附反应条件为：反应体积为0.2mL
‑
0.4mL，反应pH为8.0
‑
9.0，反应温度为25℃
‑
30℃。优选为：在26℃条件下25rpm搅拌反应2h，反应pH为8.4。
[0018]在其中的一些实施例中，每50mg所述PT Linker
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SPY Cather
‑
LX1000EP环氧载体，加入0.3mL
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0.4mL pET28b
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scFv
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Mxe GyrA
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EGFP
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SPY Tag大肠杆菌裂解上清液中。
[0019]在其中的一些实施例中，所述scFv
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Mxe GyrA
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EGFP
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SPY Tag重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，包括步骤如下：
[0020]1)scFv
‑
Mxe GyrA
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EGFP
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SPY Tag重组质粒的构建：
[0021]利用RF克隆方法将scFv和EGFP基因核苷酸编码序列与pET28a
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EGFP
‑
SPY Tag表达载体连接，
[0022]2)将培养过夜的菌液接种于LB液体培养基中扩大培养，当OD
600
为1.0时加至终浓度为0.3mM
‑
0.8mM的异丙醇
‑
β
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)，16
±
1℃诱导12
±
1h收集菌体。
[0023]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于修饰环氧载体的PT Linker
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SPY Cather重组蛋白，其特在在于，所述PT Linker
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SPY Cather重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种scFv
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Mxe GyrA
‑
SPY Tag重组蛋白，其特在在于，所述scFv
‑
Mxe GyrA
‑
EGFP
‑
SPY Tag重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种纯化HER2单链抗体的方法，其特在在于，包括如下步骤：1)将PT Linker
‑
SPY Cather基因序列插入到表达载体的多克隆位点构建重组表达质粒，并在大肠杆菌中成功表达PT Linker
‑
SPY Cather重组蛋白，纯化得到PT Linker
‑
SPY Cather重组蛋白，将PT Linker
‑
SPY Cather重组蛋白与环氧载体LX
‑
1000EP在室温下孵育，得到PT Linker
‑
SPY Cather
‑
LX1000EP环氧载体；2)将scFv
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Mxe GyrA
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EGFP
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SPY Tag重组蛋白的融合基因核苷酸编码序列插入到表达载体的多克隆位点构建重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达，获得细胞裂解上清中的scFv
‑
Mxe GyrA
‑
EGFP
‑
SPY Tag重组蛋白；3)将步骤(1)中得到的PT Linker
‑
SPY Cather
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LX1000EP环氧载体吸附步骤2)获得细胞裂解上清中的scFv
‑
Mxe GyrA
‑
EGFP
‑
SPY Tag重组蛋白；4)除去未吸附的杂蛋白，加入DTT的磷酸盐缓冲液将被吸附的scFv洗脱下来。4.根据权利要求3所述纯化单链抗体的方法，其特在在于，步骤3)中的吸附反应条件为：反应体积为0.2mL
‑
0.4mL，反应pH为8.0
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9.0，反应温度为25℃
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【专利技术属性】
技术研发人员：周妍婷，张雷，李杉，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：