四氢叶酸依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06及其应用制造技术

本发明专利技术公开了四氢叶酸（tetrahydrofolate,THF）依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06及其应用，从麦草畏降解富集液中扩增出THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所编码的麦草畏脱甲基酶的氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供的THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的脱甲基酶具有麦草畏脱甲基活性，并且降解活性显著高于已报道的麦草畏脱甲基酶Dmt和Dmt50。高于已报道的麦草畏脱甲基酶Dmt和Dmt50。高于已报道的麦草畏脱甲基酶Dmt和Dmt50。

【技术实现步骤摘要】
四氢叶酸依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06及其应用


[0001]本专利技术涉及麦草畏脱甲基酶基因
，特别是涉及四氢叶酸（THF）依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06及其应用。

技术介绍

[0002]在过去、现在和将来，农药都在农业生产上发挥重大的作用，但是农药的不科学使用导致水体、土壤和大气中农药残留超标，严重危害自然环境和人类健康。我国年农药使用量在30万吨（原药）以上，而农药的利用率只有20
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30%，其余残留进入生态环境，导致我国土壤和农产品中农药残留普遍超标。在对于残留农药的处理方法中，生物修复尤其是微生物修复安全有效、成本适中、无二次污染，适合大面积面源污染修复，是土壤有机污染物修复技术的主流和发展方向。抗除草剂转基因是解决除草剂药害的有效途径，而抗除草机的基因一般均来自微生物降解基因。
[0003]麦草畏（3,6
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二氯
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甲氧基苯甲酸）是一种广谱高效除草剂，能杀死草甘膦抗性杂草，是良好的抗除草剂转基因靶标除草剂。麦草畏在环境中的降解目前主要为微生物降解，目前已筛选到多种麦草畏的降解菌株。微生物降解麦草畏的起始步骤为脱甲基，生成无除草活性的3,6
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二氯水杨酸（3,6
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dichlorosalicylate,3,6
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DCSA）。目前已报道两种类型的麦草畏脱甲基酶：（1）单加氧酶类麦草畏脱甲基酶DMO（dicambamonooxygenase），克隆自Stenotrophomonas maltophilia DI
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6，为依赖NADH提供还原力的三组份单加氧酶。（2）四氢叶酸依赖型（tetrahydrofolate,THF）脱甲基酶：Yao et al.(2016)和Chen et al.(2019)从Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn
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20中克隆到两个THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt和dmt50。Dmt和Dmt50跟DMO一样具有很高的脱甲基活性；但和DMO相比，Dmt和Dmt50显著的缺点是其活性受到产物5
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甲基
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四氢叶酸（5
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methyl
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THF）的严重反馈抑制，这极大地限制了其应用价值。孟山都公司利用细菌来源的麦草畏脱甲基酶基因DMO成功构建了抗麦草畏作物，2018年种植面积近3亿亩。随着麦草畏混剂的开发和抗麦草畏的转基因作物技术研究的不断深入，麦草畏在世界范围内的需求量必将大幅增加。目前，少数西方生物技术巨头主导着转基因技术的产权体系，而我国还缺乏具有自主产权的抗除草剂基因（酶）资源，这严重制约了我国抗除草剂转基因作物新品种培育。因此获得新的高效麦草畏脱甲基酶及其基因资源，在抗麦草畏作物构建及麦草畏污染生物修复方面具有很好的应用价值，对推动我国农业和环境生物技术创新具有积极意义。
[0004]获得麦草畏脱甲基酶基因在治理农药残留中主要具有以下作用，（一）采用现代微生物发酵技术和酶纯化技术制成酶制剂实现土壤原位修复。（二）通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物，综上所述，开展麦草畏脱甲基酶基因的研究具有非常重要的理论和实际应用价值。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术的目的是提供一个新型高效的THF依赖型麦草畏脱甲基酶
基因dmt06来解决现有的麦草畏脱甲基酶活性低并且受到产物抑制的问题。
[0006]其解决的技术方案是：一种THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06（THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06简称dmt06）,其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
[0007]进一步的，所述dmt06从麦草畏降解富集液中扩增出得到：先从长期生产麦草畏的农药厂的排污口采集土样，通过传代培养获得一个能够高效降解麦草畏的富集液，从富集液中克隆麦草畏脱甲基酶基因的两种方案：（一）降解菌株纯化、筛选和鉴定：对有降解效果的富集液进行梯度稀释，选择合适稀释梯度的平板，挑取单菌落，对挑取的单菌进行大量培养，然后分别对其降解麦草畏的效果进行鉴定。对具有降解麦草畏的单菌进行16S rRNA基因测序，最终鉴定出具有降解麦草畏能力的菌株。然后通过基因组测序得到降解菌株的基因组草图，通过将已报道的麦草畏基因序列与新得到的麦草畏降解菌株的基因组草图进行比对，找到降解菌株中的麦草畏脱甲基酶基因。（二）通过传代、分离单菌落及降解效果鉴定的方式，最终未得到麦草畏降解菌株，可通过将已报道的麦草畏脱甲基酶基因进行序列比对，找到保守区，通过设计兼并引物，以麦草畏降解富集液的总DNA为模板，扩增富集液中麦草畏脱甲基酶基因的保守区，然后通过SEFA
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PCR扩增出保守区前后的基因片段，最终得到新的麦草畏脱甲基酶基因。
[0008]一种麦草畏脱甲基酶Dmt06（麦草畏脱甲基酶Dmt06简称Dmt06），由dmt06核苷酸序列所编码所得。
[0009]进一步的，所述的Dmt06的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0010]一种高效重组表达载体，所述表达载体中含有上述的dmt06。
[0011]优选的，所述高效重组表达载体通过dmt06插入pET
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29a(+)的NdeI和HindIII位点之间得到。
[0012]一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述的dmt06。
[0013]优选的，所述基因工程菌的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0014]本专利技术的另一目的是提供dmt06、Dmt06、基因工程菌的应用。
[0015]一种所述的THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06的应用，其应用场景包括：在构建抗麦草畏转基因作物中的应用、在降解或去除环境中麦草畏残留中的应用。
[0016]一种所述的麦草畏脱甲基酶Dmt06的应用，其应用场景包括：在降解除草剂麦草畏中的应用、在降解或去除环境中麦草畏残留中的应用。
[0017]一种所述的基因工程菌的应用，其应用场景包括：在降解或去除环境中麦草畏残留中的应用。
[0018]由于以上技术方案的采用，本专利技术与现有技术相比具有如下优点：（1）本专利技术克隆到一种新型的THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06为新基因，在NCBI（theUniProtKnowledgeBase/SwissProtdatabases）中进行Blastp在线氨基酸序列分析和同源性比较，发现该基因为一个新基因，全长（从起始密码子到终止密码子）1422bp，可编码473个氨基酸。
[0019]（2）本专利技术提供的麦草畏脱甲基酶Dmt06降解麦草畏的比酶活能达到165nmol/min/mg，显著高于Dmt（114nmol/min/mg）和Dmt50（146nmol/min/mg）。
[0020]（3）本专利技术提供的THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06还可用于构建降解麦草畏
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。2.一种权利要求1所述的THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06核苷酸序列所编码的麦草畏脱甲基酶Dmt06，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。3.一种高效重组表达载体，其特征在于，表达载体中含有如权利要求1所述的THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06。4.根据权利要求3所述的高效重组表达载体，其特征在于，通过THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06插入pET
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29a(+)的NdeI和HindIII位点之间所得。5.一种基因工程菌，其特征在于，含有如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娜，陈乐，何健，张浩，韩辉，焦思雨，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：