使用已敲除CEL1A基因的木霉属真菌菌株生产蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及一种其中cel1a基因已被敲除的属于木霉属的真菌菌株的各种用途。本发明专利技术特别涉及一种通过其中cel1a基因已被敲除的属于木霉属的真菌菌株生产蛋白质的方法，包括至少两个步骤：

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用已敲除CEL1A基因的木霉属真菌菌株生产蛋白质的方法


[0001]本专利技术涉及一种通过(i)一种其中cel1a基因已被敲除的属于木霉属的真菌菌株，和(ii)优化的诱导剂组合物生产蛋白质的方法。

技术介绍

[0002]属于木霉属，特别是里氏木霉的真菌菌株，如今主要用于生产酶。这些酶，例如纤维素酶，实际上用于将纤维素或木质纤维素生物质水解成单糖。因此，丝状真菌产生的酶可用于第二代生物燃料的生产链，甚至可用于源自(木质)纤维素生物质的糖类的生物基产品。
[0003]为了改进第二代生物燃料或生物基产品的生产，已经由此提出改进纤维素酶的生产。
[0004]例如，专利EP448430B1描述了通过里氏木霉的优化的纤维素酶工业化生产。该生产是根据分批补料方案(不提取补料)，使用含有乳糖作为诱导蛋白质生产的糖的补料溶液进行的。该发酵方法包括两个步骤：第一步是在存在过量碳源的情况下的真菌生长，以及第二步是由于以优化的流速(分批补料模式)将诱导剂添加到向培养基中的酶生产。这些步骤在生物反应器的液体介质中，同时搅拌并在氧气存在下进行，因为真菌是严格好氧的。专利EP2744899B1中描述了生产纤维素酶的优化方法的另一个例子。
[0005]传统上，特别是在实验室中，第二步中使用的补料溶液仅包含乳糖。然而，在工业上，乳糖太昂贵而不能单独用于补料溶液中。因此，已经考虑了各种解决方案来减少所使用的乳糖的量。
[0006]例如，Jourdier等人已经表明可以用其他较便宜的糖(例如葡萄糖和/或纯化木糖)代替部分乳糖(参见Jourdier等人，Biotechnology for Biofuels 2013,6:79)。在本研究中，作者分析了葡萄糖和/或木糖对通过高产里氏木霉菌株(CL847菌株)分泌酶的影响。因此，本研究得出结论，在源自高产模型菌株RutC30的工业菌株CL847中，诱导能力与补料溶液中存在的乳糖含量呈正相关：乳糖含量越高，诱导效果越好。
[0007]国际申请PCT/FR2011/000350还描述了一种生产纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的方法，在生产阶段使用包含40至65重量％的葡萄糖、21至25重量％的乳糖和10至39重量％的木糖，和因葡萄糖的分解代谢物抑制而灭活的里氏木霉真菌组合的组合物。
[0008]其中xyn1和xyn2木聚糖酶基因的启动子序列的调控元件已插入到纤维素酶启动子中的里氏木霉的修饰菌株也已描述于国际专利PCT/FR2016/050950中。因此，在所述修饰菌株中，基因可被其自身的诱导底物如乳糖、纤维二糖或纤维素诱导，但也可被木聚糖酶诱导底物如木聚糖、木糖等诱导。
[0009]因此，现有技术中已经描述了用于改进丝状真菌的纤维素分解酶的生产和由此改进的生物基产品和第二代生物燃料的发酵方法和菌株。
[0010]然而，仍然需要尽可能高效的用于生产蛋白质，特别是纤维素分解酶的新方法，特别是允许足够的生产同时使用尽可能少的乳糖以降低成本。
[0011]其中cel1a基因被敲除的里氏木霉菌株在现有技术中已有描述。例如，Zhou等人的团队(Differential Involvement ofβ
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Glucosidases from Hypocrea jecorina in Rapid Induction of Cellulase Genes by Cellulose and Cellobiose.Eukaryotic Cell 11(11)1371
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1381(2012))和Xu等人(Intracellularβ
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Glucosidases CEL1a and CEL1b Are Essential for Cellulase Induction on Lactose in Trichoderma reesei,Eukaryotic Cell 13(8),pp.1001
–
1013(2014))描述了亲本菌株里氏木霉TU
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6(ATCC MYA
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256)中的cel1a基因的敲除。Xu等人的团队特别得出结论，CEL1a蛋白是在乳糖诱导中必不可少的细胞内β
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葡萄糖苷酶。
[0012]相比之下，本专利技术基于专利技术人的意外结果，该结果表明使用含有较少乳糖或甚至根本不含乳糖的诱导组合物，和使用其中基因组已被修饰以敲除cel1a基因的木霉属的真菌，特别是里氏木霉的菌株可以诱导蛋白质的产生，其中所述含有较少乳糖或甚至根本不含乳糖的诱导组合物即相对于所述组合物中总糖含量，含有0重量％乳糖的组合物，或乳糖的含量大于所述组合物中总糖含量的0重量％且至多30重量％，特别是乳糖的含量为所述组合物中总糖含量的5重量％至30重量％。
[0013]因此，关于第二步中使用的诱导组合物的可能乳糖含量，本专利技术提出了几个实施方案：
[0014]‑
0重量％的乳糖，诱导组合物包含至少一种其他糖(在文中也称为“第二种糖”)；这里根本不再使用乳糖；
[0015]‑
或含量大于所述组合物中总糖含量的0重量％至严格小于5重量％的乳糖；
[0016]‑
或含量大于或等于所述组合物中总糖含量的5重量％至小于或等于30重量％的乳糖。
[0017]专利技术人特别表明，敲除里氏木霉菌株中的cel1a基因可以将生产阶段使用的乳糖含量除以10，甚至完全消除，同时保持与参考菌株相同的比生产率。
[0018]专利技术人特别表明，其中cel1a被敲除的菌株虽然在饲喂纯葡萄糖或纯乳糖时不产生蛋白质，但在饲喂葡萄糖/乳糖混合物时能正确地产生蛋白质，其中补料溶液中的乳糖含量在有利范围内，为总糖含量的5至30重量％，特别是总糖含量的10至20重量％。
[0019]更具体地说，本专利技术人已经表明，具有乳糖含量占总糖含量的10至15重量％的补料溶液在亲本菌株(其中cel1a基因未被敲除)中产生与纯乳糖等效的诱导作用，其中蛋白质比生产率大约为20
±
2mg
蛋白质
/g
生物量
/h。
[0020]专利技术简述
[0021]通常，本专利技术基于在蛋白质生产步骤的分批补料阶段，使用包含第二种糖和可选地包含至少乳糖的组合物，所述组合物中的乳糖含量等于所述组合物中总糖含量的0重量％，或大于所述组合物中总糖含量的0重量％且至多30重量％。
[0022]因此，本专利技术涉及一种通过其中cel1a基因已被敲除的属于木霉属的真菌菌株生产蛋白质的方法，包括至少两个步骤：
[0023]‑
第一步：在至少一种碳生长底物存在下在分批阶段中生长，和
[0024]‑
第二步：在包含至少乳糖和第二种糖的组合物的存在下，在分批补料阶段生产蛋白质，所述组合物中的乳糖含量占所述组合物中总糖含量的约0至30重量％。
[0025]因此，本专利技术涉及一种通过其中cel1a基因已被敲除的属于木霉属的真菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种通过其中cel1a基因已被敲除的属于木霉属的真菌菌株生产蛋白质的方法，包括至少两个步骤：
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第一步：在至少一种碳生长底物存在下在分批阶段中生长，和
‑
第二步：在包含至少乳糖和第二种糖的组合物的存在下，在分批补料阶段生产蛋白质，所述组合物中的乳糖含量占所述组合物中总糖含量的约0至30重量％，特别是5至30重量％。2.根据前述权利要求所述的方法，其中所述组合物中的乳糖含量为大于所述组合物中总糖含量的0重量％至5重量％，或为大于所述组合物中总糖含量的5重量％至小于10重量％，或为所述组合物中总糖含量的10重量％至至多20重量％。3.根据权利要求1至2中所述的生产蛋白质的方法，其中所述真菌属于里氏木霉物种。4.根据前述权利要求中任一项所述的生产蛋白质的方法，其中所述蛋白质是酶，特别是纤维素分解酶，例如纤维素酶或半纤维素酶。5.根据前述权利要求中任一项所述的生产蛋白质的方法，其中所述第二种糖选自葡萄糖或木糖，优选葡萄糖。6.根据前述权利要求中任一项所述的生产蛋白质的方法，其中所述组合物中的乳糖含量占所述组合物中总糖含量的约10至20重量％。7.根据前述权利要求中任一项所述的生产蛋白质的方法，其中所述组合物包含：
‑
约70
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95重量％的葡萄糖和/或木糖，和
‑
约5
‑
30重量％的乳糖。8.根据前述权利要求中任一项所述的生产蛋白质的方法，其中所述组合物包含：
‑
约80
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90重量％的葡萄糖和/或木糖，和
‑
约10
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20重量％的乳糖，并且更具体地
‑
约80
‑
90重量％的葡萄糖，和
‑
约10
‑
20重量％的乳糖。9.根据权利要求1至5中任一项所述的生产蛋白质的方法，其中：
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所述组合物包含约90
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95重量％的水溶性戊糖的粗提物和葡萄糖和5
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10重量％的乳糖，或
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所述组合物中的糖含量由100％的水溶性戊糖的粗提物和葡萄糖组成。10.根据前述权利要求中任一项所述的生产蛋白质的方法，其中所述第二种糖选自葡萄糖、木糖、纤维素生物质的酶促水解产物的单糖在乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：F，
申请(专利权)人：IFP新能源公司，
类型：发明
国别省市：