本发明专利技术公开了一种能高效分解单氰胺和氧化亚磷酸盐的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，所述重组枯草芽孢杆菌在枯草芽孢杆菌中表达氰胺水合酶和亚磷酸盐脱氢酶。本发明专利技术所提供的重组枯草芽孢杆菌能分解单氰胺产生尿素作为氮源，分解氧化亚磷酸盐成为磷酸盐作为磷源，改变氮源和磷源的来源途径，使其在特定的MOPS培养基中能正常生长，而不同时具有这两条代谢途径的杂菌微生物就会由于缺乏氮源或磷源营养物质的来源而被“饿死”，从而使重组枯草芽孢杆菌成为特定培养基的优势菌，杂菌就不能生长繁殖。能生长繁殖。能生长繁殖。
【技术实现步骤摘要】
一种能高效分解单氰胺和氧化亚磷酸盐的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
[0001]本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种能高效分解单氰胺和氧化亚磷酸盐的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。
技术介绍
[0002]近年来，随着发酵行业的迅速发展，发酵技术、发酵设备不断发展更新，在发酵管理经验越来越丰富，技术手段越发成熟的情况下，各企业的发酵染菌率也有下降。但工业发酵过程环节较多，染菌现象还是时有发生，并且一旦染菌，不仅造成原材料浪费，而且会影响生产效率，增加生产成本，破坏生产计划、扰乱生产秩序等。所以，要解决发酵中的染菌依旧是发酵企业最关切的问题之一。
[0003]造成发酵染菌的原因有很多，且常因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不善等是造成各厂污染杂菌的普遍原因。通常，为了解决发酵过程中微生物污染的问题。一般是采用增加灭菌过程和添加抗生素。但是，滥用抗生素会加速耐药菌株的产生，而灭菌过程将导致高能耗和高成本。并且，灭菌过程中的高温也会导致美拉德反应的发生。培养基中的糖和氨基酸发生美拉德反应后，会导致营养物质的流失，从而降低产量。而对工业菌株进行基因工程方面的改造，使其能够利用一些罕见的化学物质在发酵过程中抵抗环境微生物的污染，这在近几年成为了研究热点。
[0004]在分子生物学中，基因的重组表达技术已经相当成熟，可以利用基因工程的手段把不同来源的基因实现在同一菌株中共表达，从而可以赋予该菌株拥有其他菌株自身不具备的一些特殊代谢功能，使其能在发酵工业中得到更广泛的应用，降低生产成本和设备要求。
[0005]枯草芽孢杆菌作为安全级菌株，由于其清晰的遗传背景、高效的分泌能力、简单的培养条件等优势被广泛的应用于生物技术产业。其无论是用来高效表达外源蛋白还是作为口服疫苗或全细胞酶的载体，都展现出其他细菌无可比拟的优势，是研究较多、应用较广泛的菌株。但其在培养或者发酵产物过程中会受到杂菌污染，导致发酵效率降低、全细胞酶的催化效果下降，从而造成巨大的经济损失。
技术实现思路
[0006]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种能高效分解单氰胺和氧化亚磷酸盐的重组枯草芽孢杆菌。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法。
[0008]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述重组枯草芽孢杆菌的应用。
[0009]专利技术思路：本专利技术以大肠杆菌DH5α工程菌为宿主，将克隆得到的氰胺水合酶基因和亚磷酸脱氢酶基因依次连接在载体上得到重组质粒，并转化入枯草芽孢杆菌168表达菌
株中，培养得到重组枯草芽孢杆菌。本专利技术的重组枯草芽孢杆菌同时含有氰胺水合酶基因和亚磷酸脱氢酶基因，能同时表达氰胺水合酶分解单氰胺生成尿素和表达亚磷酸脱氢酶把亚磷酸盐氧化磷酸盐，为重组枯草芽孢杆菌工程菌提供生长繁殖所需要的氮源和磷源，而其他微生物由于不具备这两条获取营养的代谢途径，故使重组枯草芽孢杆菌在生长过程中成为了优势菌，从而可以有效解决枯草芽孢杆菌在工业发酵中染菌问题，同时可以降低对发酵设备的灭菌以及减少抗生素的添加。
[0010]为了解决上述第一个技术问题，本专利技术公开了一种能高效分解单氰胺和氧化亚磷酸盐的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌在枯草芽孢杆菌中表达氰胺水合酶和亚磷酸盐脱氢酶。
[0011]其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168；所述氰胺水合酶和亚磷酸盐脱氢酶的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0012]为了解决上述第二个技术问题，本专利技术公开了上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，将核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氰胺水合酶基因和亚磷酸盐脱氢酶基因连接在质粒pMA5上，得到重组质粒pMA5
‑
ptxD
‑
CAH；所得重组质粒pMA5
‑
ptxD
‑
CAH转入枯草芽孢杆菌中，培养，即得所述重组枯草芽孢杆菌。
[0013]为了解决上述第三个技术问题，本专利技术公开了上述重组枯草芽孢杆菌在降低染菌危害中的应用。
[0014]其中，所述染菌危害中菌类为除上述重组枯草芽孢杆菌外的其他菌；优选为枯草芽孢杆菌168、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和毕赤酵母中的任意一种或几种菌；进一步优选为枯草芽孢杆菌168、大肠杆菌DH5α、谷氨酸棒杆菌ATCC13032和毕赤酵母GS155中的任意一种或几种菌。
[0015]为了解决上述第三个技术问题，本专利技术还公开了上述重组枯草芽孢杆菌在分解单氰胺和/或氧化亚磷酸盐中的应用。
[0016]上述两种应用中；
[0017]其中，所述应用为将所述重组枯草芽孢杆菌接种于含有单氰胺和亚磷酸盐的发酵培养基中培养发酵，所述发酵培养基不含有其他氮源和磷源；所述亚磷酸盐为KH2PO3。
[0018]其中，所述发酵培养基中单氰胺的浓度为1～50mM，优选为20～40mM，进一步优选为30mM。
[0019]其中，所述发酵培养基中亚磷酸盐的浓度为1～30mM，优选为10～20mM，进一步优选为15mM。
[0020]其中，所述发酵培养基中还包括0.2～0.8mM MgCl2，0.1～0.35mM K2SO4，0.005～0.1mM FeSO4，1
×
10
‑4～0.001mM CaCl2，10～90mM NaCl，40～120mM MOPS，1～7mM Tricine，0.1～0.8ml/L微量元素液，10～80mg/L色氨酸，5～15g/L葡萄糖；优选为0.4～0.6mM MgCl2，0.15～0.3mM K2SO4，0.005～0.02mM FeSO4，1
×
10
‑4～0.0009mM CaCl2，30～70mM NaCl，60～100mM MOPS，3～5mM Tricine，0.3～0.6ml/L微量元素液，30～60mg/L色氨酸，8～12g/L葡萄糖；进一步优选为0.5～0.6mM MgCl2，0.2～0.3mM K2SO4，0.005～0.015mM FeSO4，1
×
10
‑4～0.0009mM CaCl2，48～52mM NaCl，78～82mM MOPS，2～6mM Tricine，0.3～0.7ml/L微量元素液，48～52mg/L色氨酸，8～12g/L葡萄糖。
[0021]其中，所述微量元素液位包括B、Co、Cu、Mn和Zn中任意一种或几种元素的溶液，优
选为包括H3BO3、CoCl2、CuSO4、MnCl2、ZnSO4中任意一种或几种元素的溶液。
[0022]其中，所述培养发酵的温度为20～40℃，优选为室温～40℃，进一步优选为37℃；所述培养发酵的转速是50～1000rpm，优选为100～400rpm，进一步优选为200rpm。
[0023]有益效果：与现有技术相本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，在枯草芽孢杆菌中表达氰胺水合酶和亚磷酸盐脱氢酶。2.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168；所述氰胺水合酶和亚磷酸盐脱氢酶的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，将核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氰胺水合酶基因和亚磷酸盐脱氢酶基因连接在质粒pMA5上，得到重组质粒pMA5
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ptxD
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CAH；所得重组质粒pMA5
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ptxD
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CAH转入枯草芽孢杆菌中，培养，即得所述重组枯草芽孢杆菌。4.权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌在降低染菌危害中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述染菌危害中菌类为除权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌外的其他菌；优选为枯草芽孢杆菌168、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和毕赤酵母中的任意一种或几种菌；进一步优选为枯草芽孢杆菌168、大肠杆菌DH5α、谷氨酸棒杆菌ATCC13032和毕赤酵母GS155中的任意一种或几种菌。6.权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌在分解单氰胺和/或氧化亚磷酸盐中的应用。7.根据权利要求4或6所述应用，其特征在于，将所述重组枯草芽孢杆菌接种于含有单氰胺和亚磷酸盐的发酵培养基中培养发酵，所述发酵培养基不含有其他氮源和磷源。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述亚磷酸盐为KH2PO3。9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述发酵培养基中单氰胺的浓度为1～50mM，优选为20～40mM，进一步优选为30mM。10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述发酵培养基中亚磷酸盐的浓度为1～30mM，优选为10～...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙文俊，张凯杰，陈勇，应汉杰，陈天鹏，高勇，王丹，刘静，王斯楠，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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