本发明专利技术公开了一种检测特异性ＩＶ型登革病毒抗原的免疫诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括包被单抗２Ｅ８Ａ５的微孔反应板、样品处理液、结合有标记物的单抗７Ａ６Ａ１、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液。该试剂盒能特异性的检测ＩＶ型登革病毒抗原，与其他３种血清型登革病毒抗原无交叉反应，检测ＩＶ型登革病毒培养上清敏感度是商品化同类试剂盒Ｐａｎ－Ｅ Ｄｅｎｇｕｅ Ｅａｒｌｙ ＥＬＩＳＡ ｔｅｓｔ ｋｉｔ的６４倍，大大提高了临床血清样本检测的灵敏度，同时也降低了临床应用中的漏检现象。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药领域，具体涉及一种医用配制品，特别是用于诊断IV型登革病毒的试剂盒。
技术介绍
登革热是一种热带传染病，通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，根据E蛋白的抗原性不同分 为4个血清型，分别为I型、n型、m型和IV型(简称DV1、 DV2、 DV3和DV4)。任何型 别的登革病毒感染均可引起一系列的临床症状，表现为隐性感染、发热、登革热、或更为严 重的登革出血热和登革休克综合征。近年来，由于国际旅游业的发展和传染性疾病的防治措 施不当，登革热广泛流行于热带和亚热带的100多个国家和地区，特别是东南亚一带的流行 甚为严重。目前，世界上约有25亿人受到登革病毒感染的威胁，每年发生登革病毒感染患者 超过1亿人，并且有50万人发展成为登革出血热或登革休克综合征，造成大约30000人死亡。 初次感染登革病毒对于同型病毒的再次感染可产生终身的免疫保护作用，但对于其它血清型 的再次感染缺乏交叉免疫保护作用，同时由于存在抗体依赖的病毒感染增强效应(ADE)，异 型登革病毒再次感染是导致登革热患者发生登革出血热的首要危险因素。而在登革疫区中， 往往存在四型登革病毒的交替流行，增加了不同血清型别登革病毒反复感染的危险性，更增 加了登革出血热发生的可能性。由于ADE的存在，增加了登革疫苗研制的难度，目前，具有保护性的登革疫苗尚未研制 成功，临床上对登革病毒感染还缺乏特异性的治疗药物。实践表明，早期确诊能大大降低登 革出血热的发病率和死亡率，因此登革热的治疗很大程度上取决于早期感染的诊断。但是， 多数登革病毒感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、寒战等流感样症状，难以和其它 发热疾病和出血热疾病区分，必须依赖于实验室的诊断。目前登革热的实验室诊断方法主要包括病毒分离、抗体和核酸检测。其中病毒分离是登 革病毒感染诊断和血清型鉴定的金标准，但该方法费时而且对于实验室的条件要求较高。尽 管病毒核酸的检测方法比传统的病毒分离法更灵敏、更快速，但分子诊断操作相对繁琐，对 技术水平要求较高，并较易发生污染导致假阳性结果，同时由于毒株的变异、潜在突变等序 列改变也可能引起假阴性结果。而抗体检测试剂不能用于早期诊断，而且由于4个血清型登 革病毒之间以及与其它病毒属间存在血清学交叉反应，特别是接种乙型脑炎病毒、黄热病毒 疫苗的人群易发生抗体假阳性反应结果。因此，建立一种能够特异性区分登革病毒四个血清 型感染的早期诊断试剂盒势在必行。登革病毒的非结构蛋白1 (nonstructuralprotein 1, NS1)是一种相对保守的糖蛋白，有膜型和分泌型两种形式，在感染细胞中高度表达，具有很强的抗原性，且研究发现在登革热患 者的早期血中存在高浓度的NS1循环抗原，因此检测急性期病人血清中的循环NS1抗原可用 于早期诊断登革病毒感染或者预警登革出血热(DHF)的发生。通过基于登革病毒NS1的抗 原捕获ELISA法来检测登革病毒的方法可分为两类， 一类是在多克隆抗体的基础上建立的， 这类方法在不同批次的抗血清中存在很大差异，难以重复和实现实验室的标准化。另一类利 用NS1的单克隆抗体来检测登革病毒，如商品化的试剂盒Pan-E Dengue Early ELISA test kit (Panbio， Queensland, Australia)禾卩Platelia Dengue NS1 Ag kits (Bio-Rad , France )。 Pan-E Dengue Early ELISA test kit含有抗I IV型登革病毒NS1的单克隆抗体，通过ELISA方法来 实现登革病毒感染的早期诊断，其敏感度、特异性和稳定性都有了较大的提高。但本专利技术人 进一步研究发现，该试剂盒对I IV型的登革病毒的敏感度不同，分别为195 PFU/mL、 195 PFU/mL、 1563 PFU/mL、 25000 PFU/mL，而早期感染登革病毒的患者血液样本中的病毒含量相对较低，用该试剂盒检测m型和iv型登革病毒的感染有可能会出现漏检现象。再者，这两种试剂盒不能区分四种血清型的登革病毒，由于不同血清型的登革病毒感染所引起的临床症 状和治疗方案是不同的，临床医师必须尽早确定哪种血清型的登革病毒感染，以便于快速采 取有效的治疗措施。因此，及时确定登革病毒感染的类型，是降低登革病毒感染死亡率的前 提，也是控制登革病毒扩散的有效措施，而目前市面上的商品化试剂盒均无法达到此目的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有高灵敏度和特异性的 IV型登革病毒NS1抗原免疫诊断试剂盒，它可直接检测到血液标本中的DV4 NS1抗原，实现登革病毒感染的早期分型诊断。为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种检测IV型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒是基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，由包被捕获抗体的微孔反应板、样品 处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液 组成，其特征在于所述的捕获抗体为单抗2E8A5，由保藏号为CCTCC一C200855的杂交瘤细 胞株2E8A5分泌得到；所述的检测抗体为单抗7A6A1，由保藏号为CCTCC—C200854的杂 交瘤细胞株7A6A1分泌得到。本专利技术试剂盒中，所述的单抗2E8A5和单抗7A6Al均是IgGl亚类的免疫球蛋白，其中 单抗2E8A5能同时与IV和ni型登革病毒的NS1蛋白结合，由保藏号为CCTCC一C200855的 杂交瘤细胞株2E8A5分泌；单抗7A6A1能特异性结合IV型登革病毒，由保藏号为CCTCC一 C200854的杂交瘤细胞株7A6A1分泌。所述的杂交瘤细胞株2E8A5和7A6A1是用重组的 DV4NS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉免疫Balb/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合，最后用HAT培养基筛选得到。本专利技术试剂盒中，所述的标记物是指能标记在抗体的非活性部位且可定量分析的物质， 例如酶；而相应的显色液则含有能与所述标记物反应并产生颜色变化的物质，例如酶的底物。 这些都是本领域的常识，本领域技术人员可根据这些常识轻易地选定标记物与相应的显色液， 如辣根过氧化物酶及其底物过氧化氢尿素和四甲基联苯胺(简称TMB)就是ELISA试验中常 用的标记物及显色液组合，也同样适用于本专利技术。所述的样品处理液、浓縮洗液和终止液均 是双抗体夹心ELISA方法中的常用试剂，所述的阳性对照物是指IV型登革病毒NS1蛋白，所 述的阴性对照物是不含IV型登革病毒NS1蛋白的空白对照物。本专利技术试剂盒是一种基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，其中所述的捕获抗体 2E8A5是一种具有交叉反应性的单抗，间接免疫荧光检测结果显示该单抗能同时结合m型和 IV型登革病毒，但检测抗体7A6A1是从一组抗IV型登革病毒NS1蛋白的单克隆抗体中筛选 出来的，能特异性结合IV型登革病毒，因此，该试剂盒能准确、快速地检测出IV型登革病毒，而与其它i型、n型和m型登革病毒以及乙型脑炎病毒、黄热病毒均无交叉反应，且对iv型登革病毒具有很高的敏感度，检测IV型登革病毒的敏感度是商品化试剂盒Pan-E Dengue Early ELISA te本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异性检测Ⅳ型登革病毒ＮＳ１抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒是基于双抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法的检测试剂盒，由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液组成，其特征在于所述的捕获抗体为２Ｅ８Ａ５，由保藏号为ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００８５５的杂交瘤细胞株２Ｅ８Ａ５分泌得到；所述的检测抗体为７Ａ６Ａ１，由保藏号为ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００８５４的杂交瘤细胞株７Ａ６Ａ１分泌得到。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：车小燕，丁细霞，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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