本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，尤其是一种具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法及其特异性引物探针组合，其中特异性引物包括PEDV上、下游引物及PEDV探针，IPC上、下游引物及IPC探针，序列分别如SEQ ID NO：1
【技术实现步骤摘要】
一种具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法及其特异性引物探针组合
[0001]本专利技术涉及病毒检测
，具体领域为一种检测PEDV的荧光PCR方法。
技术介绍
[0002]近年来，猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)引起的猪流行性腹泻(Porcine epidemicdiarrhea，PED)暴发和流行已给我国乃至全球的养猪业造成毁灭性的打击。2013～2015年猪流行性腹泻病的暴发导致美国养猪业每年损失9亿～18亿美元，韩国约40％的种猪场受到影响，损失惨重。新型猪流行性腹泻病毒毒株已成为造成猪群发生群体性腹泻疾病中最为重要的因素之一。
[0003]2021年，内蒙古自治区畜牧业生产呈现以下特点：一是生猪生产加快恢复，生猪存栏、出栏头数较快增长，2021年末，内蒙古自治区生猪存栏565.2万头，比上年增长5.8％，出栏812.9万头，比上年增长9.5％。就此情况看，内蒙古自治区生猪呈现逐年增加的良好势头，猪腹泻作为生猪养殖最常见疾病被中国动物疫病防控中心纳入《生猪常见疫病防控技术指南》中。
[0004]目前，国家标准针对猪流行性腹泻病毒的检测方法主要以普通的RT
‑
PCR检测方法及单重病原的荧光定量诊断方法为主，缺少完整的质控体系，缺乏对PCR整个流程的监控，包括对核酸提取试剂、人员操作、设备及样本中是否存在抑制物等进行监控。
[0005]因此，开发一种具有质控体系的检测PEDV的方法成为了本领域亟需解决的问题之一。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供一种具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法及其特异性引物探针组合。
[0007]本专利技术根据GenBank中已发表的“猪流行性腹泻病毒”(PEDV)(登录号：MH726401.1)及人源HBB基因(登录号：MK476504.1)主要代表病毒株序列进行分析，分别用PEDV保守的N基因和人源的HBB基因作为靶基因，利用Primer Express 3.0.1软件设计了1对PEDV特异性引物探针及内部阳性质控品(IPC)特异性的引物探针，2组由不同荧光基团标记的特异性探针(PEDV用FAM基团修饰、IPC用VIC基团修饰)。根据设计合成的两组引物探针进行双重荧光PCR方法建立，同时引入防污染酶等技术，建立了拥有完整质控体系的流行性腹泻病毒(PEDV)荧光检测方法。
[0008]具体而言，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一种检测PEDV的荧光PCR方法的特异性引物探针组合，包括：
[0010]PEDV上游引物：5
’‑
AAGAACAAATCCAGGGCCA
‑3’
；
[0011]PEDV下游引物：5
’‑
TAAACTGGCGATCTGAGCATA
‑3’
；
[0012]PEDV探针：FAM
‑
AAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTC
‑
BHQ1；
[0013]IPC上游引物：5
’‑
TGCTCGGTGCCTTTAGTGAT
‑3’
；
[0014]IPC下游引物：5
’‑
AGTCCCATAGACTCACCCTGAA
‑3’
；
[0015]IPC探针：VIC
‑
TGGCTCACCTGGACAACCTCAAGG
‑
TAMRA；其序列分别如SEQ IDNO：1
‑
6所示。
[0016]采用本专利技术所述特异性引物探针组合的具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法，包括如下步骤：
[0017](1)模板RNA的提取：提取待检样品的RNA，同时在提取板中加入内部阳性质控品(IPC)5μl参与整个核酸提取过程，对核酸提取及后续的PCR反应进行监控，提取后的核酸用于后续的PCR扩增反应；利用Thermo Fisher MagMAX CORE核酸提取方法，使用KingFisher Flex核酸提取设备提取某临床样品基因组，具体流程如下：
[0018]a.充分涡旋MagMAX
TM
CORE磁珠，确保磁珠完全重悬。
[0019]b.根据所需提取的样品数量，将下列组分混合，并增加10％的富余。每个样品所需体积MagMAX
TM
CORE磁珠20μL，MagMAX
TM
CORE蛋白酶K10μL，磁珠/蛋白酶K混合物总体积30μL；
[0020]c.根据所需提取的样品数量，将下列组分混合，并增加10％的富余。组分名称每个样品所需体积MagMAX
TM
CORE裂解液350μL，MagMAX
TM
CORE结合液350μL，裂解/结合液总体积700μL的体积；
[0021]d.分别将Wash1和Wash2试剂500μL，分装到96深孔板中；
[0022]e.将Elution试剂90μL分装到96深孔板中；
[0023]f.将待测样品200μL加入到含有磁珠和蛋白酶K及裂解液和结合液的样品板中，按照MagMAX
TM
CORE核酸提取程序进行核酸提取。
[0024](2)双重荧光定量反应体系配置：在200μl PCR管配制反应体系：含UNG酶的一步法荧光PCR反应液10μl，PEDV上游引物、PEDV下游引物、PEDV探针各0.8μl，IPC上游引物、IPC下游引物、IPC探针各0.4μl，ddH2O 1μl进行配制；将上述反应液进行预混，分装15μl，加入模板RNA5μl，然后进行上机操作；
[0025](3)将上述反应液进行预混，每管分装15μl，加入模板RNA 5μl，然后进行上机操作PCR反应，反应程序如下：
[0026]UNG酶防污染：25℃10min；1Cycle。
[0027]反转录：52℃5min；1Cycle。
[0028]预变性：95℃10s；1Cycle。
[0029]PCR反应：95℃5sec；60℃30s；40Cycles。
[0030](4)质量控制
[0031]①
对照设立：
[0032]阳性对照：已知的病原阳性样品制备的DNA模板。
[0033]阴性提取对照：使用纯净的无菌无酶水(提取时加入，全程监控污染情况)。
[0034]阴性无模板对照：使用纯净的无菌无酶水。
[0035]②
IPC添加
[0036]在样品加入前，在每个提取孔中加入5μL IPC，从核酸提取到荧光PCR全程监控实验过程。
[0037](5)实验成立条件：
[0038]阴性对照：FAM通道无Ct值或无典型的S型扩增曲线；
[0039]阴性提取对照：FAM通道无Ct值或无典型的S型扩增曲线本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测PEDV的荧光PCR方法的特异性引物探针组合，其特征在于，包括：PEDV上游引物：5
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AAGAACAAATCCAGGGCCA
‑3’
；PEDV下游引物：5
’‑
TAAACTGGCGATCTGAGCATA
‑3’
；PEDV探针：FAM
‑
AAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTC
‑
BHQ1；IPC上游引物：5
’‑
TGCTCGGTGCCTTTAGTGAT
‑3’
；IPC下游引物：5
’‑
AGTCCCATAGACTCACCCTGAA
‑3’
；IPC探针：VIC
‑
TGGCTCACCTGGACAACCTCAAGG
‑
TAMRA；其序列分别如SEQ IDNO：1
‑
6所示。2.采用权利要求1所述特异性引物探针组合的具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)模板RNA的提取；(2)双重荧光定量反应体系配置：在200μl PCR管配制反应体系：含UNG酶的一步法荧光PCR反应液10μl，PEDV上游引物、PEDV下游引物、PEDV探针各0.8μl，IPC上游引物、IPC下游引物、IPC探针各0.4μl，ddH2O 1μl进行配制；将上述反应液进行预混，分装15μl，加入模板RNA5μl，然后进行上机操作(3)PCR反应；(4)质量控制
①
对照设立：阳性对照：已知的病原阳性样品制备的DNA模板；阴性提取对照：使用纯净的无菌无酶水；阴性无模板对照：使用纯净的无菌无酶水；<...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘利军，邬锐军，郝瑞军，王建华，方伟，张浩，魏玉环，
申请(专利权)人：内蒙古正大食品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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