维持人骨髓源EPCs干性的体外扩增方法及抑制剂的应用技术

本发明专利技术公开了维持人骨髓源EPCs干性的体外扩增方法及抑制剂的应用，所述维持人骨髓源EPCs干性的体外扩增方法包括以下步骤：S1、在培养箱中建立EPCs体外培养体系；S2、在EPCs体外培养体系中加入抑制剂；S3、通过抑制剂促进EPCs体外培养体系中细胞的有氧糖酵解，提高细胞增殖能力及成血管能力，维持了干细胞的干性。所述抑制剂的应用为：所述抑制剂可应用于EPCs体外培养体系中来促进细胞的有氧糖酵解。本发明专利技术有利于提高EPCs体外扩增的速率，保持干细胞的干性，其可以改进EPCs体外扩增再回输治疗缺血性疾病的治疗技术平台，具有明确的临床转化应用价值。转化应用价值。转化应用价值。

【技术实现步骤摘要】
维持人骨髓源EPCs干性的体外扩增方法及抑制剂的应用


[0001]本专利技术涉及生物学领域，尤其涉及维持人骨髓源EPCs干性的体外扩增方法及抑制剂的应用。

技术介绍

[0002]血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)是来源于骨髓的一种前体细胞，能增殖、分化为成熟的血管内皮细胞。其来源丰富，取材简单，没有伦理争议，可以自体移植因而避免了可能的免疫排斥反应等优势。大量的动物实验已经证明了这种细胞对多种缺血性疾病治疗的安全性及有效性，而且，EPCs被应用于多种疾病治疗的临床试验，如心肌梗塞、肝硬化、肢体缺血、特发性肺动脉高压、以及本专利技术开展的治疗脑缺血的临床研究，都显示了其良好的临床应用前景。
[0003]EPCs在健康个体外周血中数量是很少的，而且，EPCs的数量与Framingham心血管危险指数负相关。然而，EPCs移植治疗的最大需求人群恰恰是缺血性疾病的高发人群，比如，高龄、存在心血管疾病危险因素的病人，其EPCs的数量及迁移修复性能均显著下降。因此，本专利技术认为在ex vivo体外扩增EPCs再自体回输这一干细胞疗法向临床转化的过程中，如何提高EPCs体外扩增的效率，保持干细胞的干性(Stemness)，这对于提高对EPCs生物学特性的认识，提高移植治疗的效果具有重要的作用，具有良好的临床转化价值。
[0004]同大多数的细胞系或干细胞培养方法一样，目前所广泛采用的EPCs扩增方法仍然是在常规培养箱在“5％ CO2,95％空气”条件下培养(氧气浓度20％)，这种状态下的氧气浓度被认为是“常氧(Normoxia)”。然而，需要注意到，干细胞在体内正常的生存的微环境(Niche)同常氧状态有巨大的区别。空气中的氧分压(pO2)为21％(160mmHg)，而经过呼吸、血循环，最后到达组织器官的pO2已下降至2％～9％(14～65mmHg)。也就是说常氧下的氧分压可能大大超过干细胞的正常需要量。过高的氧张力的危害是显而易见的，细胞在有氧代谢时因氧化应激产生的活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)会损伤细胞的DNA，造成遗传的不稳定性。比如，有证据显示在小鼠胚胎成纤维细胞体外培养过程中，20％ O2条件会比3％ O2条件下加速积累更多的基因突变。经研究后发现，现在的传统的常氧下的培养方法较1％低氧浓度下的培养，细胞增殖、克隆形成及成血管能力均有下降，而衰老指标增高，提示常氧环境下培养不利于维持EPCs的干细胞干性，因此，有必要针对上述问题进行改进。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是针对上述问题，提供一种操作简单的通过在常氧培养体系中添加抑制剂来模拟低氧环境，无需改变培养箱氧深度，但能有效提高EPCs体外扩增效率的EPCs的维持人骨髓源EPCs干性的体外扩增方法及抑制剂的应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是：
[0007]一种维持人骨髓源EPCs干性的体外扩增方法，包括以下步骤：
[0008]S1、在培养箱中建立EPCs体外培养体系；
[0009]S2、在EPCs体外培养体系中加入抑制剂；
[0010]S3、通过抑制剂促进EPCs体外培养体系中细胞的有氧糖酵解，提高细胞增殖能力及成血管能力，维持了干细胞的干性。
[0011]进一步的，所述抑制剂为柠檬酸合酶抑制剂或α
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酮戊二酸脱氢酶抑制剂。
[0012]一种抑制剂的应用，所述抑制剂可应用于EPCs体外培养体系中来促进细胞的有氧糖酵解。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有的优点和积极效果是：
[0014]本专利技术通过在现有的EPCs体外培养体系里加入柠檬酸合酶抑制剂或α
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酮戊二酸脱氢酶抑制剂，通过对柠檬酸合酶或α
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酮戊二酸脱氢酶这两种三羧酸循环的关键酶进行抑制，可以有效模拟低氧环境，令细胞在有氧条件下糖酵解增加，线粒体呼吸下降，进而促进了细胞增殖并提高其成血管能力；其改进了目前常用的体外扩增方法，提高了EPCs的体外扩增速率，从而可以有效增强了EPCs体外培养体系对于脑缺血、肢体缺血等各种缺血性疾病的移植治疗效果。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016]图1A
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图1C为人骨髓源EPCs的表型鉴定示意图；其中，图1A为流式细胞分析显示，细胞表达HLA
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ABC,CD29,CD105,CD133,CD54,CD90,CD44,部分表达HLA
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DR,KDR,不表达CD34,CD45,CD31；图1B为免疫荧光细胞化学显示，细胞表达VE
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cadherin和vWF；图1C为激光共聚焦显微镜显示，细胞能结合UEA
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1,并能饱吞DiI
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Ac
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LDL；
[0017]图2为在体外培养体系中不同浓度的PCA对细胞增殖的影响示意图，n＝6，*P<0.05；
[0018]图3A、图3B为PCA诱导细胞的代谢重编程示意图；其中,图3A为经10uM PCA处理的EPCs与对照组糖酵解和糖酵解能力的比较示意图，n＝6，*P<0.05；图3B为经PCA处理的EPCs与对照组的基础呼吸和最大呼吸的比较示意图，n＝6，**P<0.01；
[0019]图4为qRT
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PCR显示PCA处理后EPCs干性标志物的表达情况图，n＝6，*P<0.05，**P<0.01；
[0020]图5为PCA处理组与对照组EPCs体外克隆形成实验典型代表图及克隆形成数比较示意图，n＝6；
[0021]图6为PCA处理组与对照组体外成管状结构形成实验典型图及形成的管状结构长度比较统计图，n＝6，**P<0.01；
[0022]图7为在体外培养体系中不同浓度的SP对细胞增殖的影响示意图，n＝6，*P<0.05；
[0023]图8A、图8B为SP诱导细胞的代谢重编程示意图；其中，图8A为经20uM SP处理的EPCs与对照组糖酵解和糖酵解能力的比较示意图，n＝6，*P<0.05；图8B为经SP处理的EPCs与对照组的基础呼吸和最大呼吸的比较示意图，n＝6，**P<0.01；
[0024]图9为qRT
‑
PCR显示SP处理后EPCs干性标志物的表达情况图，n＝6，*P<0.05；
[0025]图10为SP处理组与对照组EPCs体外克隆形成实验典型代表图及克隆形成数比较本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种维持人骨髓源EPCs干性的体外扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、在培养箱中建立EPCs体外培养体系；S2、在EPCs体外培养体系中加入抑制剂；S3、通过抑制剂促进EPCs体外培养体系中细胞的有氧糖酵解，提高细胞增殖能力及成血管能力，维持了干细胞的干性。2.如权利要求1所述的维持人骨髓源EP...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈镇洲，林冬妮，颜楷濠，贺祺玮，陈俊雄，
申请(专利权)人：陈镇洲，
类型：发明
国别省市：