用于检测犬细小病毒的引物组及其应用、检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)的引物组及其应用、检测方法，本发明专利技术的用于检测犬细小病毒的引物组中各引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示。本发明专利技术针对犬细小病毒的VP2基因设计的LAMP反应引物组，LAMP反应中有5条特异性引物，对靶基因上7个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性、灵敏度和特异性，灵敏度达100％，特异性为90％，同时，降低了LAMP扩增的时间，通过采集和稀释粪便样本以用于犬细小病毒的检测，以及利用光谱传感器识别扩增产物LAMP反应颜色，降低了操作难度，便于快速判断CPV感染，适合宠物医院等场景下的快速即时检测。场景下的快速即时检测。场景下的快速即时检测。

【技术实现步骤摘要】
用于检测犬细小病毒的引物组及其应用、检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于LAMP技术用于检测犬细小病毒的引物组及其应用、检测方法。

技术介绍

[0002]犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)是一种高度传染性的犬病毒性疾病，通常会导致幼犬出现急性胃肠道疾病。这种疾病最常发生在6到20周大的幼崽身上，但有时成年的动物也会受到影响。一般导致犬类感染的病毒为犬细小病毒2型(CPV)，感染后会导致心肌炎和肠道炎症(胃肠炎)。除了犬类，犬细小病毒还能导致土狼和狼等野生犬科动物以及狐狸、浣熊和臭鼬等其他野生动物感染。尽管有效疫苗的开发，使犬细小病毒感染小狗的几率及致死率大大降低，但犬细小病毒爆发感染仍然频繁发生，特别是我国不强制执行犬细小病毒接种的环境下。即便是接种犬细小疫苗覆盖率高的国家和地区，由于完成全部疫苗接种需要数月时间，小狗和青春期狗仍非常容易感染犬细小病毒。
[0003]一旦狗或小狗被感染，在出现第一个症状之前会有3到7天的潜伏期。之后会出现嗜睡、抑郁、食欲不振或食欲不振等症状，然后突然高烧并伴随呕吐和腹泻等胃肠道症状，淋巴细胞减少症，一旦进入血液，感染心脏，可导致心肌发炎、功能差和心律失常等症状，严重时会引起脱水、休克及全身性败血症，最终导致犬类死亡。
[0004]迄今为止，最常见和最方便的检测CPV存在的方法是粪便ELISA(enzyme
‑
linked immunosorbent assay，免疫酶联吸附法)检测，该方法操作简便、出结果快速，但偶尔会产生假阳性或假阴性结果，因此可能需要进一步测试以确认诊断。兽医也可通过分子诊断技术——聚合酶链反应(PCR)技术来诊断粪便样本中的CPV，PCR检测准确率非常高，但需要将粪便样本送到专业的PCR实验室由专业人士进行，因此耗时较长，需要数天，且价格比较昂贵。
[0005]目前临床用于CPV的检测多采用犬细小病毒胶体金快速诊断试纸进行。该检测方法简便易行，快速且易于获得，但该方法的灵敏度差异性较大，灵敏度范围在50％
‑
90％，这是由于该检测方法需要将大量病毒颗粒排入狗的粪便中才能呈现阳性结果，且该检测方法主要使反应板放置在潮湿的环境中，可能会导致抗体的滴注浓度和稳定性下降，也会影响其灵敏度，导致该方法假阴性结果的概率会更高。为了防止这种情况，必须使用更高灵敏度的进一步技术。
[0006]分子检测已被充分证明，相较于抗原抗体检测方法具有更高的检测灵敏度、特异性和稳定性。但是基于成熟的PCR技术和目前市面上已有的基于LAMP技术的分子检测方法都只能应用于实验室内，由受过专业训练的专业人员实施，导致检测的时间及经济成本都明显增加。因此开发一种可用于临床的，操作简单的快速分子检测犬细小病毒的方法十分重要。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种用于检测犬细小病毒的引物组。
[0008]本专利技术的再一目的是提供上述引物组的应用。
[0009]本专利技术的再一目的是提供用于检测犬细小病毒的方法。
[0010]针对犬细小病毒的VP2基因序列，设计了一组灵敏度及特异性均最佳的引物组，LAMP反应中有5条特异性引物(包括上游和下游外引物(F3和B3)，上游和下游内引物(FIP和BIP)，以及环状引物(FL或BL))，对靶基因上7个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性和特异性，
[0011]其中，所述引物组中引物的核苷酸序列如下：
[0012]SEQ ID NO.1：5
’‑
TGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAG
‑3’
；
[0013]SEQ ID NO.2：5
’‑
GATGGTATTAATGTTCTATCCCATT
‑3’
；
[0014]SEQ ID NO.3：
[0015]5’‑
GCAACCATCAATGATGCAGTTAAAAATCTGCTACTCAGCCAC
‑3’
；
[0016]SEQ ID NO.4：
[0017]5’‑
CTATGCCATTTACTCCAGCAGCGAGTTGGTATGGTTGGTTTC
‑3’
；
[0018]SEQ ID NO.5：5
’‑
GAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATG
‑3’
。
[0019]又一方面，本专利技术提供上述引物组的应用，上述引物组可以应用于检测犬细小病毒的试剂盒中，或者，利用上述引物组检测犬细小病毒的方法中，利用上述引物组通过微流控芯片检测犬细小病毒的方法中，尤其是利用环介导等温扩增
‑
光谱传感器
‑
人工智能技术平台检测犬细小病毒。
[0020]具体的，根据本专利技术具体实施方式的用于检测犬细小病毒的方法，包括：使用上述的引物组，并基于环介导等温扩增
‑
光谱传感器
‑
人工智能技术平台对待测样品进行检测的步骤。
[0021]进一步的，所述环介导等温扩增的程序包括：将待测粪便样品用灭菌无酶水稀释；将待测粪便样品与2
×
LAMP预混液、引物组在65℃条件下进行LAMP扩增，25
‑
35min后扩增结束。
[0022]进一步的，所述环介导等温扩增的程序在微流控芯片中进行。
[0023]进一步的，利用光谱传感器对环介导等温扩增的扩增产物的LAMP反应颜色进行识别，并输出检测结果。
[0024]本专利技术的有益效果是，本专利技术针对犬细小病毒的VP2基因设计的LAMP反应引物，LAMP反应中有5条特异性引物，对靶基因上7个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性、灵敏度和特异性，灵敏度达100％，特异性为90％，同时，降低了LAMP扩增的时间，通过采集和稀释粪便样本以用于犬细小病毒的检测，以及利用光谱传感器识别扩增产物LAMP反应的颜色，降低了操作难度，便于快速判断CPV感染，适合宠物医院等场景下的快速即时检测。
[0025]本专利技术的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点在说明书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
[0026]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1是本专利技术的实施例对7组用于检测犬细小病毒的LAMP引物组分别进行LAMP扩本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测犬细小病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下引物：SEQ ID NO.1：5
’‑
TGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAG
‑3’
；SEQ ID NO.2：5
’‑
GATGGTATTAATGTTCTATCCCATT
‑3’
；SEQ ID NO.3：5
’‑
GCAACCATCAATGATGCAGTTAAAAATCTGCTACTCAGCCAC
‑3’
；SEQ ID NO.4：5
’‑
CTATGCCATTTACTCCAGCAGCGAGTTGGTATGGTTGGTTTC
‑3’
；SEQ ID NO.5：5
’‑
GAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATG
‑3’
。2.根据权利要求1所述的引物组在制备检测犬细小病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：关国良，陈巧玲，贾瑶瑶，
申请(专利权)人：常州先趋医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：