一株变形假单胞菌PHBA133及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株变形假单胞菌PHBA133及其应用，属于生物工程领域，所述菌株分类命名为PseudomonasplecoglossicidaPHBA133，已于2022年12月26日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：CGMCCNo.26275。本发明专利技术提供的变形假单胞菌PHBA133，遗传稳定性强，作用底物谱宽，可以发酵转化对羟基肉桂酸及衍生物为相应的醛，其中对羟基苯甲醛的转化浓度高达3.4g/L，具有工业应用潜力；生产工艺简洁，条件温和，绿色安全，避免了传统化学法面临反应时间长，高能耗、环境污染的难题，且副产物少，有利于提取分离操作。有利于提取分离操作。有利于提取分离操作。

【技术实现步骤摘要】
一株变形假单胞菌PHBA133及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一株变形假单胞菌PHBA133及其应用。

技术介绍

[0002]对羟基苯甲醛是重要的精细化工产品，是许多药物、香料和农药的关键中间体。在香料化学方面，对羟基苯甲醛可以合成大茴香醛、香兰素、洋茉莉醛、丁香醛和覆盆子酮等香料。近年来，市场对这些药物、香料和农药的需求量越来越大，对羟基苯甲醛的合成引起了人们的极大关注。
[0003]传统的对羟基苯甲醛生产工艺多采用化学合成法，以对硝基甲苯、对氯苯酚、对甲酚、苯酚为起始原料进行生产，存在成本高、环境污染严重、合成选择性差、产率低的问题。微生物法合成对羟基苯甲醛具有极大的开发应用前景，符合绿色化学的理念要求。有学者以对甲酚为原料，在特殊菌种的作用下来获得p
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HBA，对环境友好，且产率高，工艺操作简便，反应条件温和，但生产周期较长。2006年，Sachan等使用拟青霉属菌类降解香豆酸合成对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、原儿茶酸。研究结果表明，在拟青霉促香豆酸的降解过程中，对羟基苯甲醛的积累量占主导。江南大学专利202010640818.5构建大肠杆菌工程菌，在12h内将1g/L茴香醛转化为250mg/L对羟基苯甲醛。专利201710046221.6利用Bacillus megatherium OMK
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11发酵，可以转化酪氨酸合成3g/L的对羟基苯甲醛。以上研究产物浓度太低，距离工业化应用尚有一定的距离。通过筛选高活性及高稳定性的菌株是解决以上问题的关键所在。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供从土壤中分离得到的一株产对羟基苯甲醛的菌株，并应用该菌株发酵生产对羟基苯甲醛及衍生物的方法。
[0005]本专利技术的目的是通过以下方式实现的。
[0006]一株变形假单胞菌PHBA133，分类命名为Pseudomonasplecoglossicida PHBA133于2022年12月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26275，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007]本专利技术还提供所述菌株在发酵生产对羟基苯甲醛中的应用。
[0008]进一步，所述的发酵底物为对羟基肉桂酸及衍生物。
[0009]进一步，所述的应用方法：将变形假单胞菌PHBA133接种到液体发酵培养基，所述发酵培养基中的成分及终浓度为葡萄糖1～4g/L，对羟基肉桂酸1～2g/L，KH2PO43 g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，VB11mg/L，生物素0.1mg/L，FeSO42mg/L，ZnSO40.1mg/L，CuSO40.1mg/L，酵母浸粉1g/L，蛋白胨1g/L，pH7.0，在25～40℃，150～220r/min条件下振荡培养，在发酵18
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30h向发酵液中添加产物促进剂或有机溶剂，整个培养周期为36～96小时。
[0010]进一步，所述的产物促进剂为吐温
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80、Triton
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x100、EDTA及植酸中的一种或几种组合，添加量为1～3g/L。
[0011]进一步，所述的有机溶剂为乙酸丁酯、正丁醇、异戊醇或甲苯，有机溶剂和发酵液体积比例为20％(V/V)。
[0012]本专利技术与现有技术相比的有益效果：
[0013]本专利技术提供的变形假单胞菌PHBA133，遗传稳定性强，作用底物谱宽，可以发酵转化对羟基肉桂酸及衍生物为相应的醛，其中对羟基苯甲醛的转化浓度高达3.4g/L，具有工业应用潜力；生产工艺简洁，条件温和，绿色安全，避免了传统化学法面临反应时间长，高能耗、环境污染的难题，且副产物少，有利于提取分离操作。
附图说明
[0014]图1基于16S rDNA序列的系统发育进化树。
具体实施方式
[0015]为阐明对本项专利技术特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本专利技术做进一步阐述。
[0016]实施例1：Pseudomonasplecoglossicida PHBA133的鉴定及菌种特性验证
[0017]1)菌种分离及鉴定
[0018]样本采集自山东烟台近海岸海底泥沙。称取1g样本加入装有100mL无菌水的摇瓶中摇匀，梯度稀释后涂布于筛选平板上(筛选培养基：葡萄糖4g/L，对羟基肉桂酸2g/L，KH2PO43 g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，VB11mg/L，生物素0.1mg/L，FeSO42mg/L，ZnSO40.1mg/L，CuSO40.1mg/L，酵母浸粉1g/L，蛋白胨1g/L，琼脂20g/L，pH7.0)，于30℃培养箱中培养48h，喷2,4
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二硝基苯肼溶液，挑选橙色变色圈与菌落直径比值大的菌落，并划线分离纯化，将划线后长出的单菌落接入摇瓶发酵培养基中培养并测定对羟基苯甲醛的含量，筛选到一株高效合成对羟基苯甲醛的菌株。
[0019]实施例2：Pseudomonas plecoglossicidaPHBA133的鉴定
[0020]菌株PHBA133在LB培养基上呈乳白色菌落，表面光滑，边缘不规则，革兰氏染色阴性。镜检细胞呈杆状，分散排列，革兰氏染色呈阳性，无芽孢。生理生化指标如表1所示。经DNA提取、PCR扩增和测序获得的16S rRNA基因序列长度为1443bp，在GenBank上进行BLAST比对并绘制系统进化树。应用NCBI数据库中的BLAST进行相似性分析，结果表明该菌株的16S rRNA序列与GenBank中的Pseudomonas plecoglossicida菌株序列相似性高达99％以上，确定该菌株属于变形假单胞菌，命名为Pseudomonas plecoglossicidaPHBA133，于2022年12月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC NO.26275。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0021]表1菌株PHBA133生理生化特征
[0022][0023]其16S rRNA序列信息如下：
[0024]Ggatacgggcggcgggctacacatgcaagtcgagcggatgacgggagcttgctccttgattcagcggcggacgggtg
[0025]agtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggaga
[0026]aagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaatggctcaccaag
[0027]gcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcag...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株变形假单胞菌PHBA133，其特征在于，分类命名为PseudomonasplecoglossicidaPHBA133，于2022年12月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.26275。2.权利要求1所述变形假单胞菌PHBA133在发酵生产对羟基苯甲醛中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵底物为对羟基肉桂酸及衍生物。4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，将变形假单胞菌PHBA133接种到液体发酵培养基，所述发酵培养基中的成分及终浓度为葡萄糖1～4g/L，对羟基肉桂酸1～2g/L，KH2PO43g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，VB11mg/L，生物素0.1mg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯志彬，王玥，牟佳佳，郭如静，张娟，张建龙，张兴晓，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：