莱茵衣藻分泌导肽和转基因莱茵衣藻及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，尤其涉及莱茵衣藻分泌导肽和转基因莱茵衣藻及其构建方法与应用。所述莱茵衣藻分泌导肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO：1

【技术实现步骤摘要】
莱茵衣藻分泌导肽和转基因莱茵衣藻及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及莱茵衣藻分泌导肽和转基因莱茵衣藻及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]抗生素的发现及其应用使人类受益匪浅，但抗生素的频繁使用相当于对自然界的致病菌做定向筛选，易使微生物产生多重耐药性，在养殖产业的应用还可能导致环境污染及药物残留从而引发食品安全问题，由于抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)具有与传统抗生素不同的作用机制，且具有环境友好、使用安全、不易产生耐药性等优势，被认为是抗生素的理想替代产品，在医药行业、饲料和食品添加剂等领域都具有广泛的应用前景。AMPs是生物体内经诱导产生的一类具广谱抗菌活性的小分子多肽和小分子蛋白质的总称，是生物体先天免疫系统的重要组成成分。其中，抗脂多糖因子(Anti
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lipopolysaccharide factors，ALFs)是甲壳类动物体内的一种抗菌肽，一般由98
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123个氨基酸组成，包含一个信号肽序列和一个脂多糖结合结构域，脂多糖结合结构域作为ALFs的功能区，通过结合脂多糖来破坏细菌的细胞壁或细胞膜，从而实现抑制或杀死病原微生物。AMPs以细胞膜作为作用靶点而非特殊蛋白，故微生物不易产生耐药性，且其为肽类，在自然界易降解，不会在自然界累积，也不会残留于体内，故无食品安全问题，具有广阔的应用前景。但是天然抗菌肽在生物体内含量极微，存在提取困难、产量低、费时长、工艺复杂、体外活性不高等诸多问题，无法实现大规模生产，这成为制约AMPs进入实际应用的最大障碍。因此，开展AMPs基因工程研究具有重要意义，通过基因工程技术设计或改造天然抗菌肽是解决前述问题可行的办法。
[0003]目前，AMPs的异源表达主要通过大肠杆菌表达系统与酵母表达系统实现。大肠杆菌表达系统作为最早建立用于表达异源基因的表达系统，具有表达量高、操作简单、成本低等优点，但由于AMPs对细菌的杀伤作用，不能用大肠杆菌表达系统直接表达具有生物活性的抗菌肽，而如果采用融合蛋白的形式表达，易形成包涵体而降低表达蛋白的活性，且缺乏对真核蛋白的折叠、修饰以及加工的生物过程，获得的重组AMPs往往活性较低且具有细胞毒性。酵母属于真核微生物，能进行翻译后加工和修饰，具有更完备的基因表达调控机制，可弥补大肠杆菌表达系统的不足，然而其也易产生表达蛋白过度糖基化的问题，从而影响表达蛋白活性。而且，无论是大肠杆菌还是酵母表达系统，都需要异养发酵，该过程会消耗大量物质与能源且易造成环境污染。
[0004]针对于上述表达系统的不足，近年来，研究者开发了莱茵衣藻表达系统，莱茵衣藻作为一种单细胞真核绿藻，结合了细菌和高等植物的双重优势，具有生长迅速、生活周期较短、培养成本低、可进行翻译后修饰等优点，而且不含内毒素，遗传背景清晰，具有细胞核、叶绿体、线粒体3套遗传转化系统，其中，核基因组表达系统使用最多、技术最为成熟，此外，莱茵衣藻已进入人类可食用藻类名单，更可直接作为鱼、虾等水生生物的饵料，因此，莱茵衣藻表达系统具有独特的优势，可弥补大肠杆菌、酵母表达系统的相关不足。最新研究发
现，莱茵衣藻可以实现目的蛋白的胞内和胞外表达，胞外分泌表达具有分离纯化便捷、产物活性高、使用方便等优点。利用莱茵衣藻分泌表达AMPs，可实现对AMPs在体外的高效回收，简化抗菌肽饲料的制作，更可以直接作为抗菌剂使用在水产养殖中，减少抗生素的使用，这将为抗菌肽的实际应用奠定良好的基础。因此，分泌表达抗菌肽的衣藻制剂在水产养殖行业中具有重要的应用潜力。
[0005]然而，目前关于莱茵衣藻分泌表达的研究尚少，还存在分泌效率低，甚至靶蛋白不分泌等问题。Lauersen等人以碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1，CAH1)作为导肽分泌表达荧光素酶，其分泌表达量明显小于大肠杆菌或酵母表达系统；此外，研究结果还显示CAH1会干扰重组蛋白的产生进而进一步降低表达分泌量。另有Mayfield等人以琥珀酸脱氢酶组件为分泌导肽，研究显示其会干扰自剪切2A肽发挥功能从而导致mCherry蛋白无法表达和分泌。因此，完善或者改进莱茵衣藻分泌表达系统以解决抗菌肽在莱茵衣藻中表达量低甚至不表达是目前急需解决的难题。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中莱茵衣藻表达系统难以实现抗菌肽的高效分泌表达、抗菌肽在莱茵衣藻中表达量低甚至不表达的技术问题，本专利技术提供了一种莱茵衣藻分泌导肽，并提供了含有该莱茵衣藻分泌导肽的转基因莱茵衣藻及其构建方法，以及提供了前述莱茵衣藻分泌导肽或转基因莱茵衣藻在养殖业中应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0008]本专利技术第一方面提供了一种莱茵衣藻分泌导肽，所述莱茵衣藻分泌导肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO：1
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3所示中的至少一种。
[0009]进一步地，所述莱茵衣藻分泌导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0010]本专利技术第二方面提供了一种多核苷酸，用于编码如上所述的莱茵衣藻分泌导肽。
[0011]本专利技术第三方面提供了一种转基因莱茵衣藻，所述转基因莱茵衣藻含有表达载体，所述表达载体包括编码如上所述的莱茵衣藻分泌导肽的DNA序列和编码抗菌肽的DNA序列。
[0012]进一步地，编码所述莱茵衣藻分泌导肽的DNA序列选自如SEQ ID NO：4
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6所示中的至少一种。
[0013]进一步地，所述抗菌肽为斑节对虾抗脂多糖因子3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，DNA序列如SEQ ID NO：8所示。
[0014]进一步地，所述表达载体还包括光诱导启动子，编码所述莱茵衣藻分泌导肽的DNA序列和编码所述抗菌肽的DNA序列依次位于所述光诱导启动子的下游。
[0015]进一步地，构建所述表达载体的出发载体为pESVH。
[0016]本专利技术第四方面提供了如上所述的转基因莱茵衣藻的构建方法，包括以下步骤：
[0017]S1、将编码所述莱茵衣藻分泌导肽的DNA序列和编码抗菌肽的DNA序列连接到出发载体上，获得表达载体；
[0018]S2、将所述表达载体转化至莱茵衣藻受体藻株中，得到转基因莱茵衣藻。
[0019]进一步地，步骤S1中，将编码所述莱茵衣藻分泌导肽的DNA序列和编码所述抗菌肽的DNA序列融合，通过基因合成技术获得分泌导肽
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抗菌肽融合序列，然后将所述分泌导肽
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抗菌肽融合序列插入到酶切线性化的出发载体的启动子下游，获得所述表达载体。
[0020]进一步地，步骤S2中，将所述表达载体通过“珠磨法”转化至所述莱茵衣藻受体藻株中，所述莱茵衣藻受体藻株为细胞壁缺陷型藻株JUV。
[0021]本专利技术第五方面提供了如上所述的转基因莱茵衣藻在养殖业中的应用。
[0022]本专利技术的优点及积极效果为：
[0023]本专利技术提供的具有上述所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种莱茵衣藻分泌导肽，其特征在于，所述莱茵衣藻分泌导肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO：1
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3所示中的至少一种。2.根据权利要求1所述的莱茵衣藻分泌导肽，其特征在于，所述莱茵衣藻分泌导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.一种多核苷酸，其特征在于，用于编码如权利要求1或2所述的莱茵衣藻分泌导肽。4.一种转基因莱茵衣藻，其特征在于，所述转基因莱茵衣藻含有表达载体，所述表达载体包括编码如权利要求1或2所述的莱茵衣藻分泌导肽的DNA序列和编码抗菌肽的DNA序列。5.如权利要求4所述的转基因莱茵衣藻，其特征在于，编码所述莱茵衣藻分泌导肽的DNA序列选自如SEQ ID NO：4
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6所示中的至少一种。6.如权利要求4所述的转基因莱茵衣藻，其特征在于，所述抗菌肽为斑节对虾抗脂多糖因子3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，DNA序列如SEQ ID NO：8所示。7.如权利要求4所述的转基因莱茵衣藻，其特征在于，所述表达载体还包括光诱导启动子，编码所述莱茵衣藻分泌导肽的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄惠琳，欧耀辉，陈若瑜，王潮岗，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：