一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致发光传感器的制备及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致发光传感器的制备及其应用，本发明专利技术是以特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体为基础，利用铂纳米粒子介孔硅石墨烯纳米复合材料(PtNPsM

【技术实现步骤摘要】
NO.7和8所示的氨基酸；
[0010]进一步地，所述特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1
‑
3分别如：SEQ ID NO.9
‑
11所示，所述轻链可变区的CDR4
‑
6分别如：SEQ ID NO.12
‑
14所示。
[0011]进一步地，所述特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体的重链和轻链包括如SEQ ID NO.15和16所示的氨基酸；
[0012]优选地，本专利技术所述双特异性抗体的结构示意图如图1所示，该双特异性抗体是由2条重链(H)和2条轻链(L)组成，呈Y字形，与天然抗体不同的是，双特异性抗体的两条重链与轻链来源不同，故可拥有两种不同的Fab和Fc结构域，具有天然抗体难以比拟的结构优势。其中，特异性结合甲胎蛋白抗体的VH和特异性结合异常凝血酶原的VH通过linker连接形成双特异性抗体；进一步在2条多肽的C末端引入半胱氨酸，形成链间二硫键，可以提高目标抗体的稳定性。
[0013]优选地，所述linker为甘氨酸
‑
丝氨酸连接子，其结构式由(GS)n表示，n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12；进一步地，所述连接子结构式由(GGGGS)n表示，n为1,2,3,4,5；进一步地，所述连接子结构式由(GGGGS)2。
[0014]进一步地，所述双特异性抗体的结构形式不限于DART、BiTE或TandAb等。
[0015]本专利技术的目的之二是提供一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器的制备方法，将所制备的电致化学发光免疫传感器，用于同时检测甲胎蛋白和异常凝血酶原。
[0016]具体而言，本专利技术所述方法包括以下步骤：
[0017](1)铂纳米粒子介孔硅石墨烯纳米复合材料(PtNPsM
‑
SiGS)的制备：将10mL的3mg/mL氧化石墨烯水溶液，0.5g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，25mg氢氧化钠和45mL超纯水混合，超声40min；45℃下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯(TEOS)的乙醇溶液，反应11h；加入80mL的质量分数为85％的水合肼的水溶液，75℃加热3h，加热结束后，采用乙醇进行离心洗涤三次；将离心后的沉淀产品溶于丙酮中搅拌24h，离心三次；将离心后的沉淀产品溶于50mL乙醇中，加入200μL 3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌12h，离心分离；将离心后的沉淀产品溶于45mL水，得到氨基化介孔硅石墨烯纳米复合材料(M
‑
SiGS)；将4mL M
‑
SiGS水溶液和50mL铂纳米粒子溶液混合，搅拌4h，离心分离两次，取离心后底部材料进行真空干燥，得到PtNPsM
‑
SiGS；所述的TEOS乙醇溶液是由400μL TEOS溶于1.6mL的乙醇中制得；
[0018](2)称取1.5mg的PtNPsM
‑
SiGS加入到2mL的1
×
10
‑3mol/L三联吡啶钌(Ru(bpy)3Cl2)溶液、2mL的1
×
10
‑3mol/L鲁米诺(luminol)溶液和10μg/mL特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体(anti
‑
AFP/DCP)溶液中，超声3h，搅拌10h，离心分离上清，得到双特异性抗体标记luminol
‑
Ru
‑
PtNPsM
‑
SiGS/anti
‑
AFP/DCP；
[0019](3)在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干；随后在其表面上滴加10μL的10μg/mLanti
‑
AFP/DCP溶液，室温下孵化3h，然后用超纯水清洗，晾干；用超纯水洗去没有交联上的抗体，滴加质量分数为1％的牛血清白蛋白溶液，37℃下放置2h，用pH为7.5的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4℃下储存备用，制得甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器。
[0020]本专利技术的目的之三是还提供了一种应用上述所述甲胎蛋白和异常凝血酶原电致
化学发光免疫传感器用于甲胎蛋白和异常凝血酶原的同时检测的方法，所述方法包括如下步骤：
[0021](1)把已知浓度的甲胎蛋白和异常凝血酶原溶液加入到50μL的pH为7.5的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取15μL抗原混合溶液滴涂到前述所述所制备的电致化学发光免疫传感器的工作电极上，放置2h；
[0022](2)将5μL双特异性抗体标记luminol
‑
Ru
‑
PtNPsM
‑
SiGS/anti
‑
AFP/DCP滴涂到工作电极表面上，3h后用pH为7.5的PBS缓冲溶进行清洗，得到组装的工作电极；
[0023](3)将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电致化学发光设备上，在电解槽中加入15mL的30mmol/L三乙醇胺的水溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；双特异性抗体标记luminol
‑
Ru
‑
PtNPsM
‑
SiGS/anti
‑
AFP/DCP在不同的电压下产生光信号，根据所得电致化学发光的光信号强度与甲胎蛋白和异常凝血酶原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
[0024](4)将待测样品溶液代替甲胎蛋白和异常凝血酶原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白和异常凝血酶原的工作曲线的绘制方法进行检测；
[0025](5)用于甲胎蛋白(AFP)和异常凝血酶原(DCP)的检测范围：AFP浓度在0.002～3.5ng/mL，DCP抗原浓度在0.001～2.5ng/mL，AFP检出限为0.25pg/mL，DCP检出限为0.1pg/mL。
[0026]本专利技术的目的之四是上述所述双特异性抗体或上述任一项所述方法在制备用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测试剂或试剂盒中的应用。
[0027]本专利技术的目的之五是提供一种用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测试剂或试剂盒，所述试剂盒包括所述双特异性抗体。
[0028]进一步地，所述试剂或试剂盒还包括记载甲胎蛋白和异常凝血酶原的同时检测方法。
[0029]本专利技术的优点如下：首次制备了同时识别甲胎蛋白(AFP)和异常凝血酶原(DCP)的双特异性抗体，并将所述抗体应用于制备电致化学发光免疫传感器，该传感器相比于现有传感器而言，制备过程更为简便，节省了原材料，适合于大规模检测，显著提高了检测效率，该免疫传感器的制备对临床早期诊断肝癌具有重要的科学意义和应用价值。
附图说明
[0030]图1是本专利技术所述双特异性抗体的结构示意图。
具体实施方式
[0031]下面结合具体实施例对本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含特异性结合甲胎蛋白的第一个抗体的重链和轻链，以及特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体的重链和轻链。2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合甲胎蛋白的第一个抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1
‑
3分别如：SEQ ID NO.1
‑
3所示，所述轻链可变区的CDR4
‑
6分别如：SEQ ID NO.4
‑
6所示。3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合甲胎蛋白的第一个抗体的重链和轻链包括如SEQ ID NO.7和8所示的氨基酸。4.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1
‑
3分别如：SEQ ID NO.9
‑
11所示，所述轻链可变区的CDR4
‑
6分别如：SEQ ID NO.12
‑
14所示。5.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体的重链和轻链包括如SEQ ID NO.15和16所示的氨基酸。6.一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)铂纳米粒子介孔硅石墨烯纳米复合材料(PtNPsM
‑
SiGS)的制备：将10mL的3mg/mL氧化石墨烯水溶液，0.5g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，25mg氢氧化钠和45mL超纯水混合，超声40min；45℃下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯(TEOS)的乙醇溶液，反应11h；加入80mL的质量分数为85％的水合肼的水溶液，75℃加热3h，加热结束后，采用乙醇进行离心洗涤三次；将离心后的沉淀产品溶于丙酮中搅拌24h，离心三次；将离心后的沉淀产品溶于50mL乙醇中，加入200μL 3
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氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌12h，离心分离；将离心后的沉淀产品溶于45mL水，得到氨基化介孔硅石墨烯纳米复合材料(M
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SiGS)；将4mL M
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SiGS水溶液和50mL铂纳米粒子溶液混合，搅拌4h，离心分离两次，取离心后底部材料进行真空干燥，得到PtNPsM
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SiGS；所述的TEOS乙醇溶液是由400μL TEOS溶于1.6mL的乙醇中制得；(2)称取1.5mg的PtNPsM
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SiGS加入到2mL的1
×
10
‑3mol/L三联吡啶钌(Ru(bpy)3Cl2)溶液、2mL的1
×
10
‑3mol/L鲁米诺(luminol)溶液和10μg/mL特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：王谦，王腾凯，杜家杰，杨小蕾，
申请(专利权)人：山东中鸿特检生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：