一种提高水产品中诺如病毒检测率的方法技术

本发明专利技术提供一种提高水产品中诺如病毒检测率的方法，先以蛋白酶K溶液酶解贝类消化腺，然后再加入TGBE溶液进行洗脱，再加入酶解玉米淀粉封闭活性炭去除检测样品中RT

【技术实现步骤摘要】
一种提高水产品中诺如病毒检测率的方法
(一)

[0001]本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及一种提高水产品中诺如病毒检测率的方法。
(二)
技术介绍

[0002]诺如病毒(Norovirus，NoV)是引起全球非细菌性急性肠胃炎的主要食源性的重要病原体之一，属于人类杯状病毒科，是诺如病毒属中的一种病毒。诺如病毒是无包膜的单链正股RNA病毒。有着7.5
‑
7.7kb长度的基因组。共有三个开放阅读框(ORFs)，分别是ORF1、ORF2和ORF3。在ORF1中，蛋白酶把编码聚蛋白裂解成了包括聚合酶等6种非结构性蛋白。ORF2编码主要结构蛋白(VP1)，ORF3编码次要结构蛋白(VP2)。诺如病毒根据衣壳蛋白的氨基酸序列可分为7个基因型(GI～G
Ⅶ
)。其中NoV GI、NoV GII和NoV GIV的基因型最易感染人类。诺如病毒主要是通人和人直接传播，被污染的水和食物进行了间接传播。
[0003]贝类，水果，蔬菜最易受到诺如病毒的污染，其中贝类是诺如病毒的主要传播方式，贝类是滤食性动物，通过消化腺可以对病毒污染的水进行高浓度富集，因此生食贝类和加工不当，极易造成诺如病毒的感染。每年有二十多万人死于诺如病毒，尤其容易发生到学校，医院，养老院等半封闭的场所。
[0004]荧光定量PCR是现在常用的检测诺如病毒的方法之一，然而在核酸中会有脂肪，多糖，蛋白质等，因此导致PCR检测效率低，有很多低浓度病毒尚未被检测到。所以提高贝类中的诺如病毒的检测率是非常有意义的。
(三)
技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种提高水产品中诺如病毒检测率的方法，结合酶解玉米淀粉封闭活性炭，TGBE缓冲液洗脱贝类样品中的诺如病毒，减少食品中干扰荧光定量PCR的抑制剂，使用实时定量聚合酶链式反应(RT
‑
qPCR)实现快速特异性检测贝类中的诺如病毒，能够极大的提高水产品中诺如病毒的检测率。
[0006]本专利技术采用的技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种提高水产品中诺如病毒检测率的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008](1)蛋白酶K酶解贝类中的消化腺
[0009]向水产品的消化腺中加入蛋白酶K的超纯水溶液，在30
‑
40℃，200
‑
400rpm恒温振荡40
‑
80min，50
‑
70℃水浴10
‑
20min，获得酶解后的消化腺；所述水产品包括贝类；所述超纯水是无RNase超纯水；
[0010](2)TGBE缓冲溶液洗脱
[0011]向步骤(1)酶解后的消化腺中加入TGBE洗脱缓冲液，室温下100
‑
300rpm震荡20
‑
40min；然后在4℃、离心力5000
‑
15000
×
g下离心20
‑
40min，收集上清液；
[0012](3)酶解玉米淀粉封闭活性炭SCAC去除检测样品中的RT
‑
PCR的干扰
[0013]将酶解玉米淀粉封闭活性炭(SCAC)加入步骤(2)收集的上清液中，26℃、100
‑
300rpm震荡20
‑
40min，提取RNA，采用实时定量聚合酶链式反应(RT
‑
qPCR)检测诺如病毒；所述酶解玉米淀粉封闭活性炭是将α
‑
淀粉酶酶解后的玉米淀粉加水混匀后离心，取上清液与活性炭震荡4
‑
5h，烘干，获得酶解玉米淀粉封闭活性炭。
[0014]进一步，步骤(1)中，蛋白酶K超纯水溶液中蛋白酶K浓度3
‑
4U/mL，优选3.4U/mL。所述蛋白酶K超纯水溶液体积用量以消化腺质量计为0.5
‑
5mL/g，优选1mL/g。
[0015]进一步，步骤(1)中优选在37℃，320rpm恒温振荡60min，60℃水浴15min。
[0016]进一步，步骤(2)中TGBE洗脱缓冲液体积用量以步骤(1)消化腺质量计为10
‑
30mL/g，优选15mL/g。
[0017]进一步，步骤(2)中室温下150rpm震荡30min；然后在4℃、离心力10000
×
g下离心30min。
[0018]进一步，步骤(2)中，所述TGBE洗脱缓冲液组成：0.1mM Tris
‑
Hcl、0.05mM甘氨酸(Glycine)、30g/L牛肉浸膏(Beef extract)，去离子水定容到1L，pH为9.5，分装，121℃高压灭菌15min。
[0019]进一步，步骤(3)26℃、150rpm震荡30min。
[0020]进一步，步骤(3)中酶解玉米淀粉封闭活性炭与步骤(1)中消化腺质量比为0.5
‑
1.5:1，优选0.75:1。
[0021]进一步，步骤(3)中酶解玉米淀粉封闭活性炭按如下方法制备的：
[0022]①
活性炭的预处理：活性炭，用去离子水洗清至上清液澄清，烘干(优选60℃烘15h)，获得预处理后的活性炭；
[0023]②
酶解玉米淀粉的制备：将玉米淀粉加入pH6的Na2HPO4‑
柠檬酸缓冲液中，超声混匀后，加入α
‑
淀粉酶，45
‑
65℃水浴10
‑
20h；冷却至室温，用NaoH调pH至6
‑
7，离心(10000rpm，10min，优选沉淀用蒸馏水洗脱后重复离心3次)，烘干(优选60℃烘15h)，获得酶解玉米淀粉；
[0024]③
酶解淀粉封闭活性炭：将步骤
②
酶解玉米淀粉和去离子水混合后，高速匀浆，离心(700rpm离心2min)，取上清(作为封闭剂)加入步骤
①
预处理的活性炭，在32
‑
38℃、110
‑
160rpm条件下封闭3
‑
6h，过滤，滤饼烘干(优选37℃烘干4h)，得到酶解玉米淀粉封闭活性炭。
[0025]进一步，步骤
①
中，活性炭为椰壳活性炭，粒径1.25
‑
2mm。
[0026]进一步，步骤
②
中，超声混匀是在300
‑
500W超声20
‑
40min，优选400W超声30min。55℃水浴15h。
[0027]进一步，步骤
②
中，Na2HPO4‑
柠檬酸缓冲液体积用量以玉米淀粉质量计为1
‑
5mL/g，优选4mL/g；α
‑
淀粉酶用量以玉米淀粉质量计为20
‑
40μg/30g，优选31.5μg/30g。
[0028]进一步，步骤
③
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高水产品中诺如病毒检测率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)蛋白酶K酶解向水产品的消化腺中加入蛋白酶K的超纯水溶液，在30
‑
40℃，200
‑
400rpm恒温振荡40
‑
80min，50
‑
70℃水浴10
‑
20min，获得酶解后的消化腺；所述水产品包括贝类；所述超纯水是无RNase超纯水；(2)TGBE缓冲溶液洗脱向步骤(1)酶解后的消化腺中加入TGBE洗脱缓冲液，室温下100
‑
300rpm震荡20
‑
40min；然后在4℃、离心力5000
‑
15000
×
g下离心20
‑
40min，收集上清液；(3)酶解玉米淀粉封闭活性炭去除检测样品中RT
‑
PCR的干扰将酶解玉米淀粉封闭活性炭加入步骤(2)收集的上清液中，26℃、100
‑
300rpm震荡20
‑
40min，提取RNA，采用RT
‑
qPCR检测诺如病毒；所述酶解玉米淀粉封闭活性炭是将α
‑
淀粉酶酶解后的玉米淀粉加水混匀后离心，取上清液与活性炭震荡4
‑
5h，烘干，获得酶解玉米淀粉封闭活性炭。2.如权利要求1所述提高水产品中诺如病毒检测率的方法，其特征在于，步骤(1)中，蛋白酶K超纯水溶液中蛋白酶K浓度3
‑
4U/mL，所述蛋白酶K超纯水溶液体积用量以消化腺质量计为0.5
‑
5mL/g。3.如权利要求1所述提高水产品中诺如病毒检测率的方法，其特征在于，步骤(2)中TGBE洗脱缓冲液体积用量以步骤(1)消化腺质量计为10
‑
30mL/g。4.如权利要求1所述提高水产品中诺如病毒检测率的方法，其特征在于，步骤(2)中所述TGBE洗脱缓冲液组成：0.1mM Tris
‑
Hcl、0.05mM甘氨酸、30g/L牛肉浸膏，去离子水定容到1L，pH为9.5。5.如权利要求1所述提高水产品中诺如病毒检测率的方法，其特征在于，步骤(3)中酶解玉米...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖宁波，吴国平，阮璐，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：