视网膜血管与神经耦联的二维体外共培养模型的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，公开了一种视网膜血管与神经耦联的二维体外共培养模型的制备方法及其应用，所述视网膜血管与神经耦联的二维体外共培养模型的制备方法，包括采取非接触式二维培养法将视网膜神经节细胞与视网膜血管内皮细胞进行体外二维培养的步骤。本发明专利技术首次将视网膜神经节细胞与视网膜血管内皮细胞进行体外二维培养，观察视网膜血管内皮细胞以及与其相互依赖、相互作用的神经节细胞在血管高血糖下的病理生理改变，通过在体外探究高血糖环境下细胞的生物学行为能力的改变，能更好地阐述糖尿病视网膜病变的病理生理过程。好地阐述糖尿病视网膜病变的病理生理过程。好地阐述糖尿病视网膜病变的病理生理过程。

【技术实现步骤摘要】
视网膜血管与神经耦联的二维体外共培养模型的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体的说，涉及一种视网膜血管与神经耦联的二维体外共培养模型的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]视网膜血管性疾病是临床多见并且可导致视力下降的一类疾病。其病理特征是视网膜神经血管单元内环境的功能性失代偿。视网膜神经血管单元是由神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、双极细胞)、神经胶质细胞(Muller细胞和星形胶质细胞)、血管内皮细胞(内皮细胞和周细胞)所构成的内环境。研究表明，视网膜神经血管单元与视网膜血管性疾病的发生发展密切相关，是视网膜血管性疾病发病最早也是最根本的病理性改变，但是由于活体很难研究细胞之间的微环境，因此体外模拟其微环境是目前主要研究视网膜神经血管单元的方法，如图1所示。
[0003]在糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞等视网膜疾病的微血管病变中，视网膜血管内皮细胞是维持血管壁功能最直接的细胞。目前应用在视网膜血管性疾病体外细胞培养的方法主要采用单细胞培养法培养视网膜血管内皮细胞。
[0004]视网膜血管内皮细胞单细胞培养：通过体外分离培养原代视网膜微血管内皮细胞获得大量纯度高的内皮细胞，可为视网膜血管性疾病研究提供可靠的体外模型。人视网膜微血管内皮细胞、大鼠视网膜微血管内皮细胞、小鼠视网膜微血管内皮细胞、猴视网膜血管内皮细胞等来源的细胞在研究中较为常用。视网膜血管内皮细胞通常在含5％CO2和10％胎牛血清的低葡萄糖Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM)中培养。在生理条件下，单层无孔内皮细胞形成血管的腔壁，并通过与周细胞的连接来确保血管的解剖结构的完整性。内皮细胞间通过紧密连接、粘着连接和间隙连接以及严格控制跨细胞通路来确保血管的选择性、渗透性。较多研究采用体外单培养法分离原代视网膜血管内皮细胞，通过基因表达序列分析和蛋白质组学分析，探索视网膜内皮细胞的分子表型，并有助于了解视网膜疾病的发病机制。另一方面通过体外建立模型，如高葡萄糖浓度的培养基中培养视网膜血管内皮细胞可以模拟糖尿病视网膜病变的病理改变，从而探究病理过程中生物行为的改变。
[0005]此外，常应用于视网膜血管性疾病的单细胞培养种类有：视网膜神经节细胞、Muller细胞、视网膜毛细血管周细胞等。
[0006]现有的体外单细胞培养无法模拟体内正常的病理生理状态。体外单一培养视网膜血管内皮细胞是目前研究视网膜血管性疾病的常用模型之一，但这种单一体外模型缺少了其他细胞类型(RGCs、Muller细胞等)的参与，不能反映以及模拟正常自然的病理生理状态。血管内皮细胞、神经元、神经胶质细胞的相互作用对于正常的视网膜内皮细胞功能至关重要，也有助于视网膜血管疾病的发展。人体在生理和病理情况下，细胞之间以及细胞与胞外环境间具有复杂的相互作用关系，各种致病因子可通过细胞的旁分泌、自分泌、远距分泌、神经分泌或细胞内分泌等多种化学信号通路作用于靶细胞。相比于体外研究单个细胞的病
理改变，多组细胞共同参与对刺激的应答，对于后续研究更有提示作用。临床研究发现，糖尿病视网膜病变不仅会导致视网膜微血管受损，还会导致视网膜神经血管单元(包括神经胶质细胞、神经元细胞)中的细胞和组织受损，从而导致视网膜功能障碍。视网膜神经细胞之间的化学性突触和较少存在的电突触(间隙连接)在高血糖发作时都会受到影响，因此需要对细胞相互作用及其在糖尿病视网膜病变中的作用进行全面评估。而上述单细胞法培养中，大部分只考虑到采用RNA测序、蛋白组学分析来推测完整视网膜组织中单个细胞特异性基因表达的变化，尚未考虑到同一信号通路的基因共表达。综上所述，单细胞培养法无法模拟视网膜血管性疾病的生理病理状态。
[0007]现有的细胞培养均未考虑糖尿病视网膜病变是一种视网膜神经血管性病变，尚未提及神经血管的耦联作用。在高糖环境下，激活的神经元从突触中释放谷氨酸、K+和三磷酸腺苷(ATP)，通过刺激细胞产生肌醇三磷酸并且细胞内Ca
2+
水平增加。高浓度的Ca
2+
导致花生四烯酸及其代谢物能引起视网膜血管内皮细胞介导的血管舒张。神经血管间的耦联作用在临床试验中也已被证实，视网膜受全视野闪光刺激时可诱导视网膜神经元代谢增加，进而通过神经血管耦合扩张视网膜血管，尤其是较小的血管，从而最终导致视网膜血流量增加。多种针对视网膜神经血管单元成分及其相互作用的新型治疗方案，如神经营养因子、抗氧化剂、抗炎剂、细胞替代等，在动物模型和临床试验中都证明了对视网膜功能和结构的保护作用。因此，单细胞培养法在视网膜血管性疾病的发病机制及发现新的治疗靶点研究中具有局限性。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于，克服现有单细胞培养法在视网膜血管性疾病的发病机制及发现新的治疗靶点研究中具有局限性；提供一种能够观察视网膜内皮细胞以及与其相互依赖、相互作用的神经细胞在血管高血糖下的病理生理改变，通过在体外探究高血糖环境下细胞的生物学行为能力的改变，能更好地阐述糖尿病视网膜病变的病理生理过程的视网膜病变血管与神经耦联的二维体外共培养模型。
[0009]本专利技术提供一种视网膜血管与神经耦联的二维体外共培养模型的制备方法，包括采取非接触式二维培养法将视网膜神经节细胞与视网膜血管内皮细胞进行体外二维培养的步骤。
[0010]其中，包括如下步骤：
[0011]1)将视网膜神经节细胞接种于Transwell内培养，将视网膜血管内皮细胞接种于细胞培养板中培养；
[0012]2)将含有视网膜神经节细胞的Transwell置于培养视网膜血管内皮细胞的细胞培养板中。
[0013]其中，所述步骤1)中视网膜神经节细胞与视网膜血管内皮细胞的接种量比例为1：3。
[0014]其中，所述步骤1)中Transwell的孔径为0.4μm。
[0015]其中，所述步骤1)中使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基作为基础培养基。
[0016]本专利技术还提供了用于研究视网膜病变的模型，所述模型通过上述方法制备。
[0017]进一步的，所述模型为用于研究糖尿病引起的视网膜病变的模型，所述用于研究
糖尿病引起的视网膜病变的模型的制备方法中，在步骤1中使用的基础培养基中添加葡萄糖，所述基础培养基中葡萄糖的含量为25mmol/L
‑
50mmol/L。
[0018]上述的视网膜血管与神经耦联的二维体外共培养模型在制备研究视网膜病变的病理生理过程的产品中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。
[0019]上述的视网膜血管与神经耦联的二维体外共培养模型在制备研究视网膜神经节细胞与视网膜血管内皮细胞之间的相互作用或者研究神经血管的耦合作用的产品中应用也应在本专利技术的保护范围之内。
[0020]其中，所述视网膜病变的病理生理过程具体包括如下1)
‑
4)中至少一种：
[0021]1)视网膜病变过程中的视网膜血管内皮细胞管腔形成能力；
[0022]2)视网膜病变过程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种视网膜血管与神经耦联的二维体外共培养模型的制备方法，其特征在于，包括采取非接触式二维培养法将视网膜神经节细胞与视网膜血管内皮细胞进行体外二维培养的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将视网膜神经节细胞接种于Transwell内培养，将视网膜血管内皮细胞接种于细胞培养板中培养；2)将含有视网膜神经节细胞的Transwell置于培养视网膜血管内皮细胞的细胞培养板中。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中视网膜神经节细胞与视网膜血管内皮细胞的接种量比例为1：3。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中Transwell的孔径为0.4μm。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基作为基础培养基。6.一种用于研究视网膜病变的模型，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张新媛，王麒雲，陈晓思，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京同仁医院，
类型：发明
国别省市：