一种基于生物素-亲和素系统的耦合外泌体的水凝胶的制备方法和应用技术方案

本发明专利技术公开了一种基于生物素

【技术实现步骤摘要】
一种基于生物素
‑
亲和素系统的耦合外泌体的水凝胶的制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及组织工程支架材料领域，具体而言，涉及一种基于生物素
‑
亲和素系统的耦合外泌体的水凝胶的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]牙周炎是发生于牙周组织的慢性炎症性疾病，以牙齿支持结构的进行性破坏为特征，发病率极高。晚期牙周炎造成的牙周组织缺失是成人牙齿脱落的主要原因，目前尚缺乏行之有效的治疗方法。传统的牙周治疗手段(如洁/刮治术和翻瓣术等)是通过清除牙周局部菌斑、牙石，达到控制炎症发展、阻止疾病进程的目的，但这些治疗方法无法使已经破坏或者丧失的牙周组织获得重建和再生。现有的牙周再生性治疗策略包括引导组织再生术和引导骨再生术等，虽然在一定程度上可以获得牙周组织再生的效果，但临床治疗的适应症窄、可预期性差，远不能满足临床治疗需求。将新的组织工程技术引入牙周炎治疗，日益成为新世纪以来牙周再生研究的重点和核心，为晚期牙周炎患牙保留带来新希望。
[0003]近年来，干细胞外泌体(Exsosomes，EXs)作为干细胞治疗的研究热点之一，为干细胞治疗牙周炎开辟了新的研究思路。EXs是干细胞通过胞吐方式分泌的直径约40
‑
160nm的囊性小泡，内含丰富的生物活性物质，如mRNA、microRNA、DNA和蛋白质。干细胞EXs在组织再生的过程中发挥重要作用，可促进内源性干细胞向损伤部位募集、提高募集干细胞效能和调控免疫应答反应。现有研究表明，在不植入外源性干细胞的情况下，单纯应用干细胞EXs就可显著促进大鼠牙槽骨和牙周韧带的再生。
[0004]尽管干细胞EXs应用于组织再生有独特的优势和巨大的应用前景，但其生物利用率低下，提取困难，临床转化依旧面临多重挑战。首先，全身注射的干细胞EXs生物分布不均一，半衰期短。全身注射(皮下、静脉和腹腔注射等)的干细胞EXs进入血液后会很快(<2小时)富集到肝、脾、肺和胃肠等区域，进而被脾脏和肾脏的巨噬细胞清除，因此到达缺损区域的EXs数量较少。局部涂抹、注射干细胞EXs虽然可以增加EXs的浓度，但EXs会很快被血液或组织液稀释。其次，干细胞EXs主要通过膜融合作用与多种细胞结合，这种结合的靶向作用有限，大量的EXs会被非目标区域的组织细胞摄取，难以发挥修复缺损的功能。此外，干细胞EXs的提取和纯化也十分困难，应用成本较高。超速离心法是提取干细胞EXs最广泛、最可靠的方法，但1mL的细胞培养液仅能提取不足1μg的EXs，难以满足修复小鼠牙周缺损时所需的10
‑
100μg/次的数量要求。而对于人来说，治疗所需的剂量往往是小鼠的成百上千倍。因此，要实现干细胞EXs的临床转化，尤其是应用于牙周炎这种发病率高的非致死性疾病的治疗，需要显著提升干细胞EXs的再生效率，使得少量的干细胞EXs就能高效地修复组织缺损。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种基于生物素
‑
亲和素系统的耦合外泌体的水凝胶的制备方法和应用，以解决外泌体生物利用率低和再生效率不佳的技术问题。
[0006]第一方面，本申请实施例提供一种基于生物素
‑
亲和素系统的耦合外泌体的水凝胶的制备方法，所述制备方法包括：
[0007]将干细胞外泌体(EXs)和生物素加入第一溶剂中进行第一混合反应，得到生物素标记的干细胞外泌体(Biotin
‑
EXs)；
[0008]将明胶和活化生物素加入第二溶剂中进行第二混合反应，后进行透析，得到生物素化的明胶；
[0009]将生物素标记的所述干细胞外泌体和亲和素进行第三混合反应，得到亲和素化的干细胞外泌体(Avidin
‑
EXs)；
[0010]将亲和素化的所述干细胞外泌体和生物素化的所述明胶进行第四混合反应，得到耦合外泌体的水凝胶。
[0011]进一步地，所述干细胞外泌体包括骨髓间充质干细胞外泌体(MSC
‑
EXs)，所述生物素包括聚乙二醇化生物素(DSPE
‑
PEG
‑
Biotin)、DSPE
‑
PEG
‑
Biotin(MW1000)、DSPE
‑
PEG
‑
Biotin(MW2000)和DSPE
‑
PEG
‑
Biotin(MW5000)中的至少一种。
[0012]进一步地，所述明胶包括甲基丙烯酰胺明胶(GelMA)，所述甲基丙烯酰胺明胶的氨基取代度为50～65％，质量浓度为8～12％；所述活化生物素包括生物素
‑
十二聚乙二醇
‑
活性酯(NHS
‑
PEG
12
‑
Biotin)、NHS
‑
Biotin、NHS
‑
PEG3‑
Biotin和NHS
‑
PEG4‑
Biotin中的至少一种。
[0013]进一步地，所述亲和素包括链霉亲和素。
[0014]进一步地，所述将干细胞外泌体和生物素加入第一溶剂中进行第一混合反应，得到生物素标记的干细胞外泌体的步骤包括：
[0015]将所述干细胞外泌体和所述生物素加入所述第一溶剂中进行混合，得到第一混合溶液，后于35～40℃温度下反应20～40min，得到生物素标记的所述干细胞外泌体；
[0016]其中，所述第一混合溶液中生物素的摩尔浓度为15～25μmol/L，干细胞外泌体的浓度是200
‑
500ug/mL,粒径数目是1
‑4×
10
11
。
[0017]进一步地，所述将明胶和活化生物素加入第二溶剂中进行第二混合反应，后进行透析，得到生物素化的明胶的步骤包括：
[0018]将0.5～1.5mg/mL的所述明胶和5.0～5.5mg/mL的所述活化生物素加入所述第二溶剂中进行混合，室温反应6～10小时后透析24～48小时，冻干，得到生物素化的所述明胶；
[0019]其中，所述明胶和所述活化生物素的摩尔比为1:(18～22)。
[0020]进一步地，所述将生物素标记的所述干细胞外泌体和亲和素进行第三混合反应，得到亲和素化的干细胞外泌体的步骤包括：
[0021]将生物素标记的所述干细胞外泌体和所述亲和素进行混合，后于35～40℃温度下反应20～40min，得到亲和素化的干细胞外泌体；
[0022]其中，生物素标记的所述干细胞外泌体和所述亲和素的摩尔比为(1.5～2.5):1。
[0023]进一步地，所述将亲和素化的所述干细胞外泌体和生物素化的所述明胶进行第四混合反应，得到耦合外泌体的水凝胶的步骤包括：
[0024]将亲和素化的所述干细胞外泌体和生物素化的所述明胶进行混合，后于35～40℃温度下反应20～40min，得到耦合外泌体的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于生物素
‑
亲和素系统的耦合外泌体的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将干细胞外泌体和生物素加入第一溶剂中进行第一混合反应，得到生物素标记的干细胞外泌体；将明胶和活化生物素加入第二溶剂中进行第二混合反应，后进行透析，得到生物素化的明胶；将生物素标记的所述干细胞外泌体和亲和素进行第三混合反应，得到亲和素化的干细胞外泌体；将亲和素化的所述干细胞外泌体和生物素化的所述明胶进行第四混合反应，得到耦合外泌体的水凝胶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞外泌体包括骨髓间充质干细胞外泌体，所述生物素包括聚乙二醇化生物素、DSPE
‑
PEG
‑
Biotin、DSPE
‑
PEG
‑
Biotin和DSPE
‑
PEG
‑
Biotin中的至少一种。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述明胶包括甲基丙烯酰胺明胶，所述甲基丙烯酰胺明胶的氨基取代度为50～65％，质量浓度为8～12％；所述活化生物素包括生物素
‑
十二聚乙二醇
‑
活性酯、NHS
‑
Biotin、NHS
‑
PEG3‑
Biotin和NHS
‑
PEG4‑
Biotin中的至少一种。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亲和素包括链霉亲和素。5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述将干细胞外泌体和生物素加入第一溶剂中进行第一混合反应，得到生物素标记的干细胞外泌体的步骤包括：将所述干细胞外泌体和所述生物素加入所述第一溶剂中进行混合，得到第一混合溶液，后于35～...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺小涛，邓道坤，李璇，张玖久，田蓓敏，陈发明，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：