一种检测微量蛋白的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测微量蛋白的试剂盒及方法。本发明专利技术中的试剂盒基于DNA串联合成技术和CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种检测微量蛋白的试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于免疫检测领域，具体涉及一种检测微量蛋白的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]目前临床上应用的蛋白检测方法以辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、三联吡啶钌等代表的酶介导显色、化学发光、电化学发光方法为主。研究显示，这些蛋白检测方法的检测下限(LOD)仅为0.01
‑
50ng/mL，在检测低浓度靶蛋白时结果通常接近空白信号。近年来，建立针对微量蛋白的检测新技术逐渐成为研究的热点。
[0003]由于蛋白无法扩增，目前常用的策略是将蛋白信号转换为核酸信号，再利用核酸分子的可扩增性，借助聚合酶链式反应(PCR)或新型的恒温扩增方法进行扩增和信号放大，从而实现对低浓度靶蛋白的检测。其中以免疫PCR(Immuno
‑
PCR)作为代表，该技术是通过抗体标记DNA探针分子，联合抗原抗体反应和PCR扩增进行信号放大，显著提高了靶蛋白的检测灵敏度，检出限较ELISA提高了105倍以上，但是抗体共价标记DNA的步骤复杂耗时，并且强烈依赖于PCR仪等变温设备，限制了其广泛应用。新型恒温扩增技术的成熟化，大大推动了蛋白检测技术的发展。如基于滚环扩增技术(RCA)的immuno
‑
RCA能够检测到低至1pg/mL的细胞因子；基于杂交链反应(HCR)的immuno
‑
HCR通过发夹链的循环延伸反应能够将人IgG检测灵敏度提高至fg/mL水平；基于转录介导扩增(TMA)的检测技术借助T7聚合酶的持续转录反应产生大量的RNA扩增子，并结合荧光适配体的设计，能够检测到低至50fg/mL的HER2蛋白。然而，尽管这些新型的检测技术实现了靶蛋白的高灵敏检测，但检测过程仍依赖于实时的循环扩增反应，一方面导致了检测时间的增加，另一方面极易导致样品间的交叉污染而出现假阳性结果，影响检测的重复性和稳定性。此外，一些新型平台如等离子激元纳米传感器、超顺磁偶联与分子信标平台以及蛋白质芯片等研究，也大大促进了微量蛋白检测领域的发展。虽然这些技术灵敏度高、所需样品量少、无需实时扩增反应，但是依赖于特定的检测设备或仪器，且造价昂贵、成本较高，限制了其广泛应用。
[0004]近年来，基于成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)系统在分子检测领域的相关研究受到广泛关注，其中以CRISPR/Cas12a系统为代表。CRISPR/Cas12a是II类V型CRISPR系统效应蛋白，借助crRNA的特异性引导，与靶DNA形成Cas12a
‑
crRNA
‑
DNA三元复合物，变构激活Cas12a蛋白的非特异性旁切割核酸酶活性，目前已用于检测包括核酸和蛋白质在内的各种靶标。然而，CRISPR/Cas12a系统的敏感性不高，在检测蛋白时仍然需要与PCR或等温扩增技术如重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导恒温扩增(LAMP)等进行联合和实时扩增，使得其依赖于特定仪器(如PCR仪)或具有特定功能的催化酶(如重组酶)，增加了检测成本；此外，高灵敏的实时扩增反应易引起样品交叉污染，导致检测重复性差。
[0005]基于现有技术存在的问题，本专利技术旨在建立一种新型、灵敏度高、稳定性好、无需实时扩增反应、成本低廉的微量蛋白检测方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种检测微量蛋白的试剂盒。
[0007]本专利技术第二方面的目的，在于提供上述试剂盒的应用。
[0008]本专利技术第三方面的目的，在于提供一种检测微量蛋白的方法。
[0009]本专利技术所采取的技术方案是：
[0010]本专利技术的第一方面，提供一种检测微量蛋白的试剂盒，包括：DNA探针、短串联重复序列、crRNA。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述短串联重复序列的5
’
端序列与DNA探针的反向序列互补，3
’
端以ACAACTTAAC序列作为串联重复单元。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述crRNA的识别序列与短串联重复序列部分互补，所述crRNA与短串联重复序列互补的长度优选为20～22nt。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述crRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，
[0015]所述DNA探针的序列如下所示：5
’‑
CAGTAGCTCATCTTTTTTTTTACGCAGTGTTCCTATAGTTCGATCCAG
‑3’
；
[0016]所述短串联重复序列的序列如下所示：5
’‑
CTGGATCGAACTATAGGAACACTGCGTATTCAACTTAACACAACTTAACACAACTTAAC(ACAACTTAAC)
n
‑3’
；所述n＝200～500。
[0017]所述crRNA序列如下所述：5
’‑
GGGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGUUAAGUUGUGUUAAGUUG
‑3’
。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述DNA探针5
’
端为Biotin修饰，3
’
端为C6
‑
SH或C6
‑
HS
‑
SH修饰。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒中还包括捕获抗体、检测抗体、链霉亲和素、金纳米颗粒、二硫苏糖醇、链霉亲和素磁珠、FnCas12a、荧光报告探针。
[0020]所述荧光报告探针的序列如下所示：5
’‑
TTATT
‑3’
。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述荧光报告探针5
’
端为荧光基团修饰，所述荧光基团为HEX、FAM、TEX或Cy5，3
’
端为淬灭基团修饰，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测抗体为生物素化检测抗体。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒中还包含缓冲液，所述缓冲液包含：酶切缓冲液、洗涤缓冲液；优选地，所述酶切缓冲液为NEB 2.1；所述洗涤缓冲液为含0.03～0.07％Tween
‑
20的8～12mM PBS溶液(pH 7～8)。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述纳米金颗粒的直径为10～50nm。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，所述短串联重复序列(ssDNA串联子)的制备方法为：将Bst DNA聚合酶、Hairpin、dATP/dTTP/dCTP solution Mix、dGTP Cleaner、MgSO4、PBS充分混匀置于水浴箱中35～39℃孵育10～20min，再加入P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测微量蛋白的试剂盒，包括：DNA探针、短串联重复序列、crRNA。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述短串联重复序列的5
’
端序列与DNA探针的反向序列互补，3
’
端以ACAACTTAAC序列作为串联重复单元；所述crRNA的识别序列与短串联重复序列部分互补。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针的序列如下所示：5
’‑
CAGTAGCTCATCTTTTTTTTTACGCAGTGTTCCTATAGTTCGATCCAG
‑3’
；所述短串联重复序列的序列如下所示：5
’‑
CTGGATCGAACTATAGGAACACTGCGTATTCAACTTAACACAACTTAACACAACTTAAC(ACAACTTAAC)
n
‑3’
；所述n＝200～500；所述crRNA序列如下所述：5
’‑
GGGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGUUAAGUUGUGUUAAGUUG
‑3’
。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括捕获抗体、检测抗体、链霉亲和素、金纳米颗粒、二硫苏糖醇、链霉亲和素磁珠、FnCas12a、荧光报告探针；优选地，所述荧光报告探针的序列如下所示：5
’‑
TTATT
‑3’
。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含缓冲液，所述缓冲液包含：酶切缓冲液、洗涤缓冲液；优选地，所述酶切缓冲液为NEB 2.1。6.权利要求1～5任一项所述的试剂盒在检测微...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾木圣，刘万里，王域，冯国开，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：