磁性γ－Ｆｅ２Ｏ３纳米粒子模拟酶应用于生物检测的方法涉及磁性γ－Ｆｅ２Ｏ３纳米粒子模拟酶，并提供了其应用于生物检测的方法，利用磁性γ－Ｆｅ２Ｏ３纳米粒子模拟酶替代辣根过氧化物酶ＨＲＰ应用于生物检测，检测的步骤包括：将磁性γ－Ｆｅ２Ｏ３纳米粒子表面上的羧基与特异性分子探针进行偶联，构建特异性纳米探针；纳米探针与相应待测靶标分子特异性结合；用包含过氧化物和供氢底物的显色液进行显色，并测定吸光度值或进行显微观察，从而实现对靶标分子的定性和定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及磁性Y-FeA纳米粒子模拟酶，并提供了其应用于生物检测的方法， 属于纳米材料及生物医学纳米
技术介绍
磁性氧化铁纳米粒子(Fe304、 Y-Fe203)因其丰富的磁学特性和良好的生物相容 性，在磁共振成像对比剂、磁靶向药物载体、细胞与生物分子分离、生物传感与检 测以及磁感应肿瘤热疗等生物医学领域有广泛的应用。另外，在工业废水处理方面， 磁性氧化铁纳米粒子因具有较高的有机物羟基化的活性而用于苯酚等有毒物质的清 除(苯酚等有机物羟基化后毒性降低)。近年来，中国科学院的研究者们还发现了 四氧化三铁(Fe304)磁性纳米粒子具有内在的模拟酶活性，可用于替代过氧化物酶 进行免疫检测，这在医学、生物技术及环境化学等领域有着深远的应用价值。针对模拟酶方面，早在19世纪，法国科学家Fenton就采用Fe"活化&02氧化 酒石酸，被认为是最先对过氧化物酶催化中心金属离子的化学催化模拟，其基本反应式为<formula>formula see original document page 3</formula> 由A和A来看，Fe"/Fe2+的催化反应式(b)是催化反应循环的瓶颈，限制了 Fenton 试剂在酶模拟作用中的研究应用。其它物质如金属卟啉、金属酞菁、卟啉、联吡啶、 血红素、血红蛋白、细胞色素C、细胞色素P450、漆酶、叶绿素、氯化血红素(hemin)、 高铁血红素(hematin)等等在模拟酶方面也都有所研究。过氧化物酶是广泛存在于生物体内的一类氧化还原酶,通过其内部的变价铁元 素以及外部结构能催化HA氧化氢供体底物。在生命活动过程中，过氧化物酶主要 是催化生物体内的氧化物或过氧化物氧化分解其它毒素。目前广泛应用于生物检测 的过氧化物酶是从天然植物中提取的辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase ， 朋P)。但是服P价格昂贵,且保存及实验条件苛刻，容易失活，在酶联免疫分析上因 分子较大而不利于抗原抗体结合,并且标记过程复杂。因此，寻找能够替代HRP的模 拟酶是酶催化反应的热点。在众多酶模拟物中，Fe3(X磁性纳米粒子已经被发现不仅能像Fenton试剂一样 表现出一定的酶活性，而且比酶稳定、制备方法简单、成本低，易于大规模制备， 它还兼具有磁性等其他多功能特性，因此更具研究意义和广泛的应用价值。除了 FeA磁性纳米粒子外，厂 &03是另外一种磁性较强的氧化铁纳米粒子，其可由Fe304 纳米粒子直接氧化而来，易于批量制备和保存，由于广「6203磁性纳米粒子中只含有 三价铁，因此相对于Fe304纳米粒子来说不易被氧化，具有稳定的磁学和化学稳定性。 但由于y-Fe203磁性纳米粒子中缺乏二价铁，其本身类酶活性大大降低，从而严重限 制了其作为模拟酶的应用。本专利技术的最大创新即是提供了一种通过表面修饰提高 广FeA磁性纳米粒子类酶活性并将其应用于生物检测的方法。表面修饰的磁性 Fe203磁性纳米粒子同时具有优良的稳定性和类酶活性，另外表面修饰还提供了进 行生物分子偶联所必须的功能基团，其应用于生物检测具有低成本、稳定和使用方 便的特点，同时可结合磁特性进行功能化设计。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种磁性广Fe2(X纳米粒子模拟酶应用于生物检测的方法，通过表面修饰提高Y-Fe203磁性纳米粒子类酶活性并将其应用于生物检测。技术方案FeA磁性纳米粒子具有很好的类过氧化物酶活性，但是由于固有的化学不稳定性(其中亚铁离子易被氧化)，其作为模拟酶的活性会随着保存时间而发生变化，从而导致生物检测的不稳定性。磁性Y-Fe203纳米粒子具有很好的化学稳定性，但是类酶活性较低。为了提高磁性Y-FeA磁性纳米粒子的类酶活性，本专利技术提出了通过用富含羧基的分子对其进行表面修饰，增加纳米粒子模拟酶与底物的亲和力，从而增强其催化能力。同时，本专利技术还提供了应用磁性Y-Fe203磁性纳米粒子模拟酶进行生物检测的具体方法和步骤。利用磁性Y-Fe203纳米粒子模拟酶替代辣根过氧化物酶HRP应用于生物检测，检测的步骤包括将磁性Y-Fe203纳米粒子表面上的羧基与特异性分子探针进行偶联，构建特异性纳米探针；纳米探针与相应待测靶标分子特异性结合；用包含过氧化物和供氢底物的显色液进行显色，并测定吸光度值或进行显微观察，从而实现对靶标分子的定性和定量检测。其中所述的磁性Y-Fe203纳米粒子模拟酶尺寸介于l-100nm，表面被多元羧酸或富含羧基的高分子所修饰，在pH 4-10范围内均带负电荷。所述磁性广Fe203纳米粒子模拟酶能催化过氧化物和供氢底物进行显色反应；所述供氢底物包括四甲基联苯胺TMB、四甲基联苯胺硫酸盐TMBS、邻苯二胺OPD、 二氨基联苯胺DAB、 二氨基联苯胺四盐酸DAB-4HC1、 5-氨基水杨酸5_AS、邻联甲苯胺OT或连氮二铵盐ABTS;所述过氧化物包括过氧化氢或过氧化脲。所述多元羧酸包括二巯基丁二酸、柠檬酸、苹果酸或酒石酸；所述富含羧基的高分子包括聚丙烯酸、海藻酸、多聚谷氨酸或羧基化葡聚糖。所述特异性分子探针包括蛋白、抗体、核酸或多肽；所述待测靶标分子存在于溶液或体液中，被固定或捕获在固体基质上，或分布在组织或细胞的表面。有益效果1) 本专利技术最大创新点是提供了一种将磁性Y-Fe203纳米粒子作为模拟酶来替代辣根过氧化物酶应用于生物检测的方法。与辣根过氧化物酶比较，磁性厂Fe203纳米粒子作为模拟酶稳定、制备方法简单、成本低，易于大规模制备，它还兼具有磁性等其他多功能特性，因此更具研究意义和广泛的应用价值。例如，可利用外磁场促进磁性纳米探针向下扩散与待测靶标分子结合，不仅可以提高检测效率，还可以降低纳米探针的使用量。2) 利用表面分子修饰来改变磁性Y-Fe203纳米粒子作为模拟酶的活性，提供了一种裁剪和优化模拟酶活性和功能的方法，不仅能改善酶活性、进一步增加纳米粒子稳定性和生物相容性，还提供了表面进一步偶联生物分子的功能基团，有利于标记蛋白、核酸等生物分子，从而方便用于生物检测。附图说明图1.不同有机分子修饰的Y-Fe203磁性纳米粒子，催化HA氧化TMB反应过程的对比图。纵坐标所示650nm处吸光度数值的增加表示酶催化反应产物的浓度随时间4逐渐增加。(■) Y-Fe203,(働)Y-Fe2(V二巯基丁二酸，(▲) &203/柠檬酸，(▼)y-FeA/酒石酸，( ) Y-FeA/Y-氨丙基三乙氧基硅烷，H)没有纳米粒子催化，单独HA与TMB反应(TMB指底物3, 3, 5, 5-四甲基联苯胺)。图2. 二巯基丁二酸修饰的Y-FeA磁性纳米粒子("rFeA/DMSA)、 ？6304磁性纳米粒子及HRP催化底物TMB与HA的表观酶促动力学曲线图。其中，HRP指辣根过氧化酶，TMB指底物3, 3， 5， 5-四甲基联苯胺。其中，图2a与2b指FeA磁性纳米粒子，图2c与2d指y-FeA/dmsa磁性纳米粒子，图2e与2f指hrp。图3.使用广「6203磁性纳米粒子-羊抗人IgG (FeA-GAHIgG)纳米探针检测人IgG的ELISA过程示意图。待检测人IgG首先被包被在基底上，空余位点用牛血清白蛋白(BSA)封闭，Fe203-GAHIgG纳本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种磁性γ－Ｆｅ↓［２］Ｏ↓［３］纳米粒子模拟酶应用于生物检测的方法，其特征在于利用磁性γ－Ｆｅ↓［２］Ｏ↓［３］纳米粒子模拟酶替代辣根过氧化物酶ＨＲＰ应用于生物检测，检测的步骤包括：将磁性γ－Ｆｅ↓［２］Ｏ↓［３］纳米粒子表面上的羧基与特异性分子探针进行偶联，构建特异性纳米探针；纳米探针与相应待测靶标分子特异性结合；用包含过氧化物和供氢底物的显色液进行显色，并测定吸光度值或进行显微观察，从而实现对靶标分子的定性和定量检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，杨婷，王春雨，赵寅岗，黄超，彭芳芳，马明，顾宁，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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