一种抗大熊猫PRL单克隆抗体、杂交瘤细胞株及PRL酶联免疫检测方法技术

本发明专利技术公开了一种抗大熊猫PRL单克隆抗体、杂交瘤细胞株及PRL酶联免疫检测方法。该方法以杂交瘤细胞株PRL

【技术实现步骤摘要】
一种抗大熊猫PRL单克隆抗体、杂交瘤细胞株及PRL酶联免疫检测方法


[0001]本专利技术属于大熊猫催乳素检测方法
，具体涉及一种抗大熊猫PRL单克隆抗体、杂交瘤细胞株及PRL酶联免疫检测方法。

技术介绍

[0002]圈养大熊猫经有效配种后即进入妊娠期。圈养大熊猫的妊娠期长短变化很大，从83天到200天不等。关于大熊猫妊娠期的研究尤其是妊娠诊断是一项重要的大熊猫圈养繁育关键技术。多年来，它一直是个难题。人们对大熊猫妊娠机制了解甚少：配种是否有效？大熊猫是否进入妊娠状态？目前还没有办法准确检测，给饲养管理带来一定困难。其中大熊猫胚胎发育存在滞育的现象对妊娠监测造成了巨大的困难。
[0003]胚胎滞育是胚胎发育到囊胚阶段后胚胎处于休眠状态，细胞增殖停滞，当内外环境适宜时，才能激活胚胎使其重新开始发育、着床的生理现象。胚胎滞育将交配与生产两个重要的繁殖阶段分离，以确保两者都发生在物种生存最有利的时刻，它被认为是确保动物成功繁殖以及新生儿存活的进化策略之一。目前，已发现130多种动物的胚胎发育过程中存在胚胎滞育的现象，其中已确定包括大熊猫在内的现存已知的8种熊科动物全部都发现胚胎滞育。
[0004]催乳素是一种由垂体前叶腺嗜酸细胞分泌的蛋白质激素。主要作用为促进乳腺发育生长，刺激并维持泌乳，还有刺激卵泡促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)受体生成,启动延迟着床等作用。在专性滞育的动物中，光周期通过调节垂体催乳素的分泌来影响胚胎滞育及随后胚胎发育的重新启动。催乳素浓度通过诱导ODC基因(鸟氨酸脱羧酶)的表达对终止水貂胚胎滞育和胚胎发育起着重要作用。ODC蛋白是生产多胺(即腐胺)的速率限制酶，可以诱导水貂胚胎的再活化。在兼性滞育中，如大型有袋类动物，催乳素通过浓度的变化诱导或抑制黄体的发育和分泌。催乳素受体存在于黄体细胞表面，可通过抑制催乳素分泌来终止休眠状态。哺乳刺激通过神经系统促进催乳素的释放。在弯曲翼蝙蝠中，催乳素浓度的增加可以诱导黄体静止结束并开始植入，但孕激素对黄体功能没有影响。
[0005]目前研究表明，胚胎滞育的物种进入滞育时、滞育期间和胚胎滞育后重新激活的过程都不同程度地依赖于催乳素、雌激素及孕激素三种激素，但不同物种之间的变化差异很大，从而导致了不同的物种特征。从而导致了不同的物种特征。以水貂为典型的物种中，在交配之后由于夜间褪黑素水平高，囊胚进入滞育，导致催乳素水平降低。滞育的重新激活是由春分后光周期的增加触发的，催乳素增加随后卵巢孕激素合成也增加，此类物种只有催乳素可以终止胚胎滞育；对塔玛沙袋鼠等物种，在交配后如果有幼袋，囊胚将进入乳期滞育，由高水平催乳素维持，一旦催乳素抑制被消除，随后由孕激素脉冲重新激活滞育囊胚；在小鼠中，如果交配发生在产后，催乳素水平增加，从而抑制雌激素水平的升高，并导致囊胚进入滞育期，此过程由高水平催乳素和孕激素维持，并可由高水平雌激素终止。目前，雌激素和孕激素在大熊猫尿液中已有可靠的检测方法，缺乏针对大熊猫催乳素的检测方法，
催乳素在大熊猫妊娠期的调控模式有待研究。
[0006]综上所述，建立一种大熊猫尿液中催乳素的检测方法，并通过此检测方法进一步掌握大熊猫妊娠期催乳素的变化，是一个亟待解决的问题。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种抗大熊猫PRL单克隆抗体、杂交瘤细胞株及PRL酶联免疫检测方法，本专利技术提供两种特异的抗大熊猫催乳素抗体，并利用这两种抗体作为包被抗体和标记抗体及大熊猫催乳素重组蛋白研发了大熊猫尿液催乳素的检测方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0009]一种大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，以杂交瘤细胞株PRL
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1和/或杂交瘤细胞株PRL
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5分别产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体进行检测；
[0010]其中，杂交瘤细胞株PRL
‑
1的保藏编号为CCTCC NO:C202183；杂交瘤细胞株PRL
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5的保藏编号为CCTCC NO:C202172，均于2021年10月28日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
[0011]进一步地，对大熊猫催乳素进行检测时，使用杂交瘤细胞株PRL
‑
1和杂交瘤细胞株PRL
‑
5产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体分别作为一抗或二抗。
[0012]进一步地，抗大熊猫PRL单克隆抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的大熊猫催乳素特异序列作为免疫原，并由杂交瘤细胞株PRL
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1和PRL
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5分泌。
[0013]进一步地，大熊猫PRL单克隆抗体的制备方法为：
[0014](1)设计大熊猫催乳素特异序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并使其与KLH偶联，形成免疫原PRL
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KLH；
[0015](2)采用免疫原PRL
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KLH免疫小鼠；
[0016](3)细胞融和得到抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株PRL
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1和PRL
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5；
[0017](4)扩大培养即可分别得到杂交瘤细胞株PRL
‑
1和PRL
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5产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体。
[0018]进一步地，以大熊猫尿液作为检测底物。
[0019]进一步地，包括以下步骤：
[0020](1)将大熊猫尿液加入至抗大熊猫PRL单克隆抗体包被的酶标板中，同时加入PRL重组蛋白标准品，于35～37℃孵育30～35min；
[0021](2)用洗涤液洗涤酶标板后，加入抗大熊猫PRL单克隆抗体
‑
HRP复合物，于35～37℃孵育30～35min；本步骤中使用的抗大熊猫PRL单克隆抗体与步骤(1)中的抗大熊猫PRL单克隆抗体来源不同；
[0022](3)用洗涤液洗涤酶标板后，加入底物显色试剂，于室温孵育5～10min后，加入反应终止液停止反应；
[0023](4)用酶标仪测量并计算PRL含量即可。
[0024]进一步地，底物显色试剂为TMB显色液。
[0025]进一步地，反应终止液为浓度为1M的硫酸溶液。
[0026]上述检测方法，或抗大熊猫PRL单克隆抗体在对大熊猫妊娠期的胚胎发育监测中
的应用。
[0027]一种试剂盒，包括上述杂交瘤细胞株PRL
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1和/或杂交瘤细胞株PRL
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5分别产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体。
[0028]一种载体，包括上述抗大熊猫PRL单克隆抗体。
[0029]上述试剂盒或载体在大熊猫催乳素检测，或对大熊猫妊娠期的胚胎发育监测中的应用。
[0030]一种抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株PRL
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，其特征在于，以杂交瘤细胞株PRL
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1和/或杂交瘤细胞株PRL
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5分别产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体进行检测；其中，所述杂交瘤细胞株PRL
‑
1的保藏编号为CCTCC NO:C202183；杂交瘤细胞株PRL
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5的保藏编号为CCTCC NO:C202172，均于2021年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心。2.根据权利要求1所述的大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，其特征在于，对大熊猫催乳素进行检测时，使用杂交瘤细胞株PRL
‑
1和杂交瘤细胞株PRL
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5产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体分别作为一抗或二抗。3.根据权利要求1所述的大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，其特征在于，所述抗大熊猫PRL单克隆抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的大熊猫催乳素特异序列作为免疫原，并由杂交瘤细胞株PRL
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1和PRL
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5分泌。4.根据权利要求1～3任一项所述的大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，其特征在于，以大熊猫尿液作为检测底物。5.根据权利要求4所述的大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将大熊猫尿液加入至抗大熊猫PRL单克隆抗体包被的酶标板中，同时加入PRL重组蛋白标准品，于35～37℃孵育...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡开来，张梦诗，王东辉，王神飞，胡贤彪，李非平，王涓，刘玉良，侯蓉，兰景超，吴永胜，
申请(专利权)人：成都大熊猫繁育研究基地，
类型：发明
国别省市：