FDH-GDH融合蛋白、编码基因及FDH-GDH共进化体系和共进化方法技术

本发明专利技术公开了一种FDH

【技术实现步骤摘要】
FDH
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GDH融合蛋白、编码基因及FDH
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GDH共进化体系和共进化方法


[0001]本专利技术涉及一种FDH
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GDH融合蛋白、编码基因及FDH
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GDH共进化体系和共进化方法。

技术介绍

[0002]1,3
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二羟基丙酮(1,3
‑
Dihydroxyacetone，DHA)是最简单的酮糖，化学性质活泼，是一种重要的化工医药中间体，广泛应用于化工、医药、食品等领域，具有广阔的市场前景。DHA的合成方法主要有化学合成法和微生物发酵法。传统的化学合成法是以重金属原子作为活性成分，需要在十分严格的条件下进行反应，而且过程消耗大量的能量，催化活性比较低，同时对环境有严重的污染。即化学合成法存在原料成本高、反应条件苛刻、生产设备要求高、产品收率低以及对环境造成污染等问题。而微生物发酵法是利用生物酶催化生产DHA，该法是以甘油为底物，利用微生物代谢过程所产生的甘油脱氢酶，对甘油二号位的羟基进行脱氢反应，生产DHA。因此，与化学合成法相比，生物转化法的优势在于反应条件温和、反应专一性强、环境污染小、底物利用率高、催化效率高。
[0003]现有的微生物转化甘油生产DHA普遍存在底物和产物对生产菌株的抑制效应，存在提高甘油浓度时转化率降低，生产周期延长等问题，从而导致DHA的产率难以提高。

技术实现思路

[0004]本专利技术主要目的是提供一种甘油脱氢酶和CO2还原酶联用的方法，在固定CO2产甲酸的同时，将甘油转化成1,3
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二羟基丙酮。
[0005]本专利技术采用的技术方案为：
[0006]一种FDH
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GDH融合蛋白，所述融合蛋白包含具有CO2还原酶活性的第一氨基酸序列和具有甘油脱氢酶活性的第二氨基酸序列，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间通过连接肽连接。
[0007]优选的，所述连接肽为(GGGGS)3、(GS)3或者(EAAAK)3。
[0008]优选的，所述第一氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，第二氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
[0009]优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。
[0010]本专利技术还公开了上述的FDH
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GDH融合蛋白的编码基因。
[0011]优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
[0012]优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
[0013]优选的，所述载体含有上述的FDH
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GDH融合蛋白编码基因，以及表面展示体系的编码基因。
[0014]优选的，所述载体为pET28a，表面展示体系采用Lpp
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OmpA或IN3表面展示体系。
[0015]本专利技术还公开了一种FDH
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GDH融合蛋白表面展示工程菌，其特征在于含有上述的
融合蛋白表达载体。
[0016]优选的，所述工程菌为大肠杆菌。
[0017]上述的FDH
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GDH融合蛋白表面展示工程菌在催化合成1,3
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二羟基丙酮中的应用。
[0018]本专利技术还公开了一种FDH
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GDH共进化体系，其特征在于包括：
[0019](1)甲酸生物传感器，所述甲酸生物传感器编码FHLA基因和Kana抗性基因，并利用可调控启动子启动FHLA基因的表达，FHLA启动子调控Kana抗性基因的表达；
[0020](2)FDH
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GDH突变体库质粒，所述FDH
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GDH突变体库质粒系使用易错PCR扩增上述的FDH
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GDH融合蛋白编码基因，将扩增后的FDH
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GDH融合蛋白基因克隆到表达载体中而成；
[0021](3)宿主菌，转化有上述甲酸生物传感器与FDH
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GDH突变体库质粒的宿主菌。
[0022]优选的，所述可调控启动子为Tac启动子。
[0023]优选的，所述甲酸生物传感器的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
[0024]优选的，所述表达载体为pET32a。
[0025]优选的，所述宿主菌为大肠杆菌。
[0026]本专利技术还公开了一种FDH
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GDH共进化方法，其步骤包括：
[0027](1)构建甲酸生物传感器：利用Tac启动子启动FHLA基因的表达，FHLA启动子调控Kana抗性基因的表达；
[0028](2)获得FDH
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GDH突变体库质粒：使用易错PCR扩增权利要求5或6所述的FDH
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GDH融合蛋白编码基因，将扩增后的FDH
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GDH融合蛋白基因库克隆到pET32a载体中，获得FDH
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GDH突变体库质粒；
[0029](3)筛选：将FDH
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GDH突变体库质粒转入到含甲酸生物传感器的大肠杆菌中，通过IPTG和高浓度Kana平板的筛选，挑取生长速度快的单克隆菌株，进行催化测试，选择其中产量增强的菌株，即含有进化后的FDH
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GDH融合蛋白。
[0030]甘油脱氢酶(GDH)是以甘油为底物生产1，3
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二羟基丙酮的关键酶，本专利技术将通过表面展示系统将甘油脱氢酶展示于大肠杆菌细胞膜外，提高甘油与甘油脱氢酶的结合程度，从而提高甘油的转化效率，有效避免了高浓度甘油对细胞的抑制作用，且实现酶的高效利用。本专利技术使用了两种的表面展示系统，第一种为Lpp
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OmpA展示系统，可将具有催化活性的酶呈现在大肠杆菌外膜上，并产生了各种各样的全细胞生物催化剂。OmpA为大肠杆菌β
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桶状外膜蛋白，以β
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折叠形成桶样结构，跨越外膜，并且能够转运相对分子质量相当大的蛋白质。而脂蛋白(Lipoprotein，Lpp)是另一种外膜蛋白，借于氨基端的脂质部分锚定在外膜上，也是大肠杆菌表面最丰富的脂蛋白，而脂蛋白信号肽与OmpA部分肽段融合组成一个复合展示系统。
[0031]本专利技术的第二种展示体系为冰核蛋白(Ice nucleation protein，INP)展示系统。INP是细菌表面展示系统中经典的载体蛋白，属于细菌种属中的一种分泌型表面蛋白。INP作为一种较为常用的载体蛋白存在于多种细菌中，如荧光假单胞菌、假单胞杆菌、黄单胞菌属和欧氏杆菌等，所以其突变体种类多、功能各异。INP蛋白可以有效提高靶标蛋白质的展示量，最大限度保持靶标蛋白质的活性，能展示的靶标蛋白种类多，且靶标蛋白不会对宿主造成不良影响。本专利技术选择的冰核蛋白INP是以丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)为模板，于广州艾基生物技术有限公司合成，运用PCR扩增得到冰核蛋白INP的基因组序列(I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种FDH
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GDH融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包含具有CO2还原酶活性的第一氨基酸序列和具有甘油脱氢酶活性的第二氨基酸序列，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间通过连接肽连接。2.根据权利要求1所述的FDH
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GDH融合蛋白，其特征在于所述连接肽为(GGGGS)3、(GS)3或者(EAAAK)3。3.根据权利要求1或2所述的FDH
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GDH融合蛋白，其特征在于：所述第一氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，第二氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。4.根据权利要求1所述的FDH
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GDH融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。5.权利要求1
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3中任一项所述的FDH
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GDH融合蛋白的编码基因。6.根据权利要求5所述的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。7.权利要求4所述的FDH
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GDH融合蛋白的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。8.一种FDH
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GDH融合蛋白表达载体，其特征在于所述载体含有权利要求5
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7中任一项所述的FDH
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GDH融合蛋白编码基因，以及表面展示体系的编码基因。9.根据权利要求8所述的FDH
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GDH融合蛋白表达载体，其特征在于所述载体为pET28a，表面展示体系采用Lpp
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OmpA或IN3表面展示体系。10.一种FDH
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GDH融合蛋白表面展示工程菌，其特征在于含有权利要求8或9所述的融合蛋白表达载体。11.根据权利要求10所述的FDH
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GDH融合蛋白表面展示工程菌，其特征在于所述工程菌为大肠杆菌。12.权利要求10或11所述的FDH
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GDH融合蛋白表面展示工程菌在催化合成1,3
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二羟基丙酮中的应用。13.一种FDH
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GDH共进化体系，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志乾，赖诗静，吴奕瑞，江翱，崔华，郑晓茂，吴嵩，
申请(专利权)人：态创生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：