双功能蛋白质和包含其的药物组合物制造技术

双功能蛋白质和包含其的药物组合物。本发明专利技术涉及包含生物活性蛋白和成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白的双功能蛋白质，以及包含其的药物组合物。本发明专利技术提供了通过将生物活性蛋白和FGF突变蛋白连接至免疫球蛋白的Fc区而制备的双功能蛋白质，其具有改善的药理学效力、体内持续时间和蛋白质稳定性。根据本发明专利技术的双功能蛋白质表现出改善的药理学效力、体内持续时间和蛋白质稳定性，并且含有所述双功能蛋白质作为活性成分的药物组合物可以有效地用作用于糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎或心血管疾病的治疗剂。管疾病的治疗剂。管疾病的治疗剂。

【技术实现步骤摘要】
双功能蛋白质和包含其的药物组合物
[0001]本申请是申请号为201680062638.5、专利技术名称为“双功能蛋白质和包含其的药物组合物”的中国专利申请的分案申请，该母案申请是2016年10月28日提交的PCT国际专利申请PCT/KR2016/012300进入中国国家阶段的申请。


[0002]本专利技术涉及包含生物活性蛋白和成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白的双功能蛋白质，以及包含其的药物组合物。

技术介绍

[0003]胰高血糖素样肽
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1(GLP
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1)是由31个氨基酸组成的肠降血糖素激素，其由肠道中的L细胞在受到食物等刺激时分泌。其生物效应通过经由GLP
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1受体的细胞内信号传导产生，所述受体是在靶组织如胰腺的β细胞、脑等中表达的G蛋白偶联受体。血液中分泌的GLP
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1具有不到2分钟的非常短的半衰期，这由酶二肽基肽酶
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4(DPP
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4)对N端氨基酸的切割导致的活性损失引起。由于GLP
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1基于血糖水平刺激胰腺中β细胞分泌胰岛素，因此其对降低血糖有很强的作用而不诱导低血糖。此外，在多种动物模型和人中，施用GLP
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1导致体重减轻，已知这是由于其对食欲抑制使得食物摄入减少引起的。GLP
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1诱导β
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细胞增殖并通过胰腺中β细胞中表达的GLP
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1受体抑制由糖脂毒性导致的细胞死亡，从而增强β
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细胞的生存力。胰高血糖素过量分泌会增加血糖，这已知是糖尿病患者高血糖的原因之一。另外，已知GLP
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1作用于胰腺中的α
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细胞，通过抑制蛋白激酶A(PKA)蛋白特异性胰高血糖素的分泌来抑制空腹血糖升高。
[0004]毒蜥外泌肽
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4(Exendin
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4)是临床上重要的GLP
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1受体激动剂。毒蜥外泌肽
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4是具有39个氨基酸残基的多肽，并且通常在Gila Monster蜥蜴的唾液腺中产生。已知毒蜥外泌肽
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4与GLP
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1具有52％的氨基酸序列同源性，并与哺乳动物中的GLP
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1受体相互作用(Thorens等(1993)Diabetes 42：1678
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1682)。已显示毒蜥外泌肽
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4体外刺激胰岛素产生细胞分泌胰岛素，并且在等摩尔条件下诱导的胰岛素产生细胞的胰岛素释放强于GLP
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1。虽然毒蜥外泌肽
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4强烈刺激胰岛素分泌以降低啮齿类动物和人二者的血糖水平且作用持续时间长于GLP
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1，但毒蜥外泌肽
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4在没有GLP
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1的哺乳动物中表现出抗原性，因为其具有这样的动物中不熟悉的表位。
[0005]已在临床上证实了GLP
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1和毒蜥外泌肽
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4类似物(例如利拉鲁肽和百泌达(byetta))改善人中葡萄糖控制的能力。已报道了GLP
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1通过抑制凋亡和诱导增殖来增加β细胞群。此外，还报道了GLP
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1作为抑制胃酸分泌和胃排空的肠激素起作用，同时增强饱腹感信号，从而降低食欲。GLP
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1的这些作用可以解释当向患有2型糖尿病的患者施用GLP
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1类似物时观察到的体重减轻。另外，GLP
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1在啮齿类动物缺血后表现出心脏保护作用。
[0006]已经进行了多种尝试来开发长效GLP
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1类似物。临床证实的长效GLP
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1类似物包括度拉糖肽(dulaglutide)(WO 2005/000892)和阿必鲁肽(albiglutide)(WO 2003/059934)。度拉糖肽是一种Fc融合的GLP
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1类似物，阿必鲁肽是一种白蛋白融合的GLP
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1类似物，这二
者的药代动力学谱允许每周施用一次。这两种药物每周施用一次具有降低血糖和减轻体重的优异作用，并且与百泌达和利拉鲁肽相比，这两种药物在治疗方面还提供了极大改进的便利。
[0007]同时，在肝中合成的成纤维细胞生长因子21(FGF21)是已知在葡萄糖和脂质稳态中发挥重要作用的激素。FGF21在表达FGF21特异性受体(即FGF受体)和β
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klotho复合物二者的肝、脂肪细胞、胰腺β细胞、脑中的下丘脑和肌肉组织中展示药理学作用。已经报道，在多种糖尿病和代谢疾病的非人灵长类动物和鼠模型中，FGF21可以以胰岛素非依赖性方式降低血糖水平，减轻体重，和降低血液中的甘油三酯和低密度脂蛋白(low
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density lipoprotein，LDL)浓度。此外，由于其改善胰岛素敏感性的作用，FGF21具有开发作为糖尿病和肥胖的新治疗剂的潜力(参见WO2003/011213)。
[0008]因此，为了开发基于FGF21的新抗糖尿病药，已经尝试了通过基于野生型FGF21序列通过替换、插入和缺失一些氨基酸构建FGF21突变体来提高其生物学活性和体内稳定性(参见WO2010/065439)。然而，由于FGF21具有非常短的半衰期，已经证明如果直接用作生物治疗剂，其是有问题的(Kharitonenkov，A.等(2005)Journal of Clinical Investigation 115：1627
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1635)。在小鼠中，FGF21的体内半衰期为1至2小时，并且在猴中为2.5至3小时。因此，对于FGF21以其当前形式用作糖尿病的治疗剂，需要每日施用。
[0009]已经报道了尝试提高FGF21重组蛋白的体内半衰期的多种方法。一个这样的实例是将聚乙二醇(PEG)(即聚合物材料)与FGF21连接以增加其分子量，由此抑制肾排泄并提高体内保留时间(参见WO2012/066075)。另一种方法尝试通过将其与结合至人白蛋白的脂肪酸融合来提高半衰期(参见WO2012/010553)。另一个实例尝试通过产生激动剂抗体来在维持与在野生型FGF21等同的药理学活性的同时提高半衰期，所述激动剂抗体与单独或作为与β
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klotho复合物的人FGF受体特异性结合(参见WO2012/170438)。在另一个实例中，通过制备长效融合蛋白来提高半衰期，在所述长效融合蛋白中IgG的Fc区与FGF21分子结合(参见WO2013/188181)。
[0010]在可用于产生长效药物的各种技术中，广泛使用了Fc融合技术，因为其具有较少的利用其他方法时见到的缺点，例如在提高体内半衰期的同时诱导免疫应答或毒性。为了开发作为长效治疗药物的Fc融合FGF21蛋白，应满足以下条件。
[0011]首先，应最小化由融合引起的体外活性降低。FGF2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.双功能蛋白质，其包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；生物活性蛋白或其突变体或片段；和免疫球蛋白的Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQ ID NO：68)；(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQ ID NO：69)；(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQ ID NO：70)；(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，以及上述突变(1)至(5)的一种或更多种；和(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。2.根据权利要求1所述的双功能蛋白质，其中通过突变引入的所述FGF21突变蛋白的氨基酸残基N是糖基化的。3.根据权利要求1所述的双功能蛋白质，其中所述生物活性蛋白选自胰岛素、C肽、瘦蛋白、胰高血糖素、胃泌素、胃抑制性多肽(GIP)、胰淀素、降钙素、胆囊收缩素、肽YY、神经肽Y、骨形态发生蛋白
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6(BMP
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6)、骨形态发生蛋白
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9(BMP
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9)、胃泌酸调节素、催产素、胰高血糖素样肽
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1(GLP
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1)、胰高血糖素样肽
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2(GLP
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2)、鸢尾素、含纤连蛋白III型结构域蛋白5(FNDC5)、爱帕琳肽、脂联蛋白、C1q和肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRP家族)、抵抗素、内脂素、网膜蛋白、视黄醇结合蛋白
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4(RBP
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4)、肠高血糖素、血管生成素、白介素22(IL
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22)、毒蜥外泌肽
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4和生长激素。4.根据权利要求3所述的双功能蛋白质，其中所述生物活性蛋白选自GLP
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1、其突变体和毒蜥外泌肽
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4。5.根据权利要求4所述的双功能蛋白质，其中所述GLP
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1的突变体具有由SEQ ID NO：43至46中任一个表示的氨基酸序列。6.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：金埈焕，林世荣，徐旼志，崔铉浩，金度勋，朱美敬，朴珠英，金瑟吉，林尚勉，金锺均，南受延，
申请(专利权)人：株式会社柳韩洋行，
类型：发明
国别省市：