BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种BCR

【技术实现步骤摘要】
BCR
‑
ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质及其制备方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，特别是涉及一种BCR
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ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质及其制备方法。

技术介绍

[0002]BCR
‑
ABL1融合基因由9号染色体长臂(9q34)上的原癌基因埃布尔森小鼠白血病病毒基因同源物1(abselson murine leukemia viraloncogene homolog 1，ABL1)和22号染色体长臂(22q11)上的断裂点集簇区基因(break point cluster region，BCR)之间的平衡相互易位构成，是一种典型的费城染色体(philadelphia chromosome，Ph)。研究发现，携带BCR
‑
ABL1融合基因的染色体异常是患慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的关键因素，并且约95％的CML患者中，融合基因BCR
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ABL1为P210型。因此，BCR
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ABL1 P210型融合基因成为了诊断CML的重要指标之一，随之其转录水平的动态变化也成为了白血病预后判断的可靠指标，对白血病预后判断和预测奠定了基础。
[0003]近年来，我国检测白血病特异性融合基因的技术方法正在逐步建立和完善。目前检测BCR
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ABL1的方法有免疫组织化学法(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、基于PCR技术和高通量测序法(Next Generation Sequencing，NGS)等。
[0004]在现有的各种技术中，实时定量逆转录聚合酶链式反应(RT
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qPCR)对BCR
‑
ABL1的分子监测已成为评估患者反应、监测微小残留疾病(monitor minimal residual disease，MRD)和检测复发的必要手段。然而，从样品采集到内参选择再到结果报告，RT
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qPCR的操作过程在不同实验室之间的差异很大，缺乏重复性，同时部分BCR
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ABL1荧光定量PCR试剂的质量问题也是造成“假阴性”和“假阳性”的重要原因之一。
[0005]CN108265117A公开了一种BCR
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ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质及其制备方法和用途。该技术方案在候选参考物质制备时，先设计引物，采用分子克隆技术构建含有BCR
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ABL1融合基因e14a2亚型的重组质粒候选参考物质；经酶切电泳、测序验证后，实时荧光定量PCR进行均匀性和稳定性评价；评定测量不确定度。该方法虽然提供了BCR
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ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质，但是不能用于定量P210的b2a2、b3a2亚型，而且质粒为DNA形式，与基因组大小差异非常大，也不能参与逆转录步骤，另外其定量方法为荧光定量PCR方法，与常规的检测方法相同，不具有高等级可溯源的特性，所以用于BCR
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ABL1融合基因的定量检测和溯源有显著的缺陷。
[0006]因此，急需开发一种具有准确性高且可溯源的BCR
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ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质，用于检验各个分析方法的灵敏度和准确性、相关试剂验证评价以及实验室质量控制。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种BCR
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ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质及其制备方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
[0009]一种BCR
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ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)提取含有BCR
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ABL1 P210型突变的细胞系基因组RNA，检测其浓度及纯度；
[0011](2)以所述BCR
‑
ABL1 P210型突变的细胞系基因组RNA为模板采用逆转录试剂盒及PCR扩增得到有目标融合突变的基因片段，通过Sanger测序PCR产物来验证目标基因序列的正确性；
[0012](3)添加一定酵母RNA溶液于RNA solution中制备成RNA储存缓冲液；
[0013](4)将所述细胞系基因组RNA添加至所述RNA储存缓冲液中稀释成一定浓度的标准品溶液；
[0014](5)设计并获得BCR
‑
ABL1 P210型融合基因b2a2特异性引物1和引物2及特异性探针1，所述引物1、引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0015]设计并获得BCR
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ABL1 P210型融合基因b3a2特异性引物3和引物4及特异性探针2；所述引物3和引物4的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0016]设计并获得ABL
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WT基因特异性引物5和引物6及特异性探针3；所述引物5和引物6的核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，所述探针3的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
[0017](6)采用一步法逆转录数字PCR方法，以所述的BCR
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ABL1 P210型融合突变基因组RNA为模板进行PCR扩增，采集荧光信号来检测BCR
‑
ABL1 P210型融合基因b2a2和b3a2的表达，从而获得BCR
‑
ABL1 P210型融合基因b2a2、b3a2和ABL
‑
WT拷贝数含量和突变基因丰度作为其量值。
[0018]进一步的，所述步骤(3)和步骤(4)中，在配置一定浓度的RNA储存缓冲溶液以及标准品溶液时，采用天平称量法进行称量稀释混合。
[0019]进一步的，所述步骤(3)中，酵母RNA浓度为5
‑
500ng/μL。
[0020]进一步的，所述步骤(5)中，探针1、探针2和探针3的5
’
端标记FAM荧光基团，3
’
端标记BHQ1荧光基团。
[0021]进一步的，所述步骤(5)中，引物1和引物2的反应浓度为500nM，所述的探针1的反应浓度为400nM；所述的引物3和引物4的反应浓度为400nM，所述的探针2的反应浓度为300nM；所述的引物5和引物6的反应浓度为500nM，所述的探针3的反应浓度为400nM。
[0022]进一步的，所述一步法逆转录数字PCR方法，其反应体系包括基因组：0～100ng，2
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One
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step SuperMix(Bio
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Rad)5μL，reverse tran本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种BCR
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ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取含有BCR
‑
ABL1 P210型突变的细胞系基因组RNA，检测其浓度及纯度；(2)以所述BCR
‑
ABL1 P210型突变的细胞系基因组RNA为模板采用逆转录试剂盒及PCR扩增得到有目标融合突变的基因片段，通过Sanger测序PCR产物来验证目标基因序列的正确性；(3)添加一定酵母RNA溶液于RNA solution中制备成RNA储存缓冲液；(4)将所述细胞系基因组RNA添加至所述RNA储存缓冲液中稀释成一定浓度的标准品溶液；(5)设计并获得BCR
‑
ABL1 P210型融合基因b2a2特异性引物1和引物2及特异性探针1，所述引物1、引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；设计并获得BCR
‑
ABL1 P210型融合基因b3a2特异性引物3和引物4及特异性探针2；所述引物3和引物4的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；设计并获得ABL
‑
WT基因特异性引物5和引物6及特异性探针3；所述引物5和引物6的核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，所述探针3的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；(6)采用一步法逆转录数字PCR方法，以所述的BCR
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ABL1 P210型融合突变基因组RNA为模板进行PCR扩增，采集荧光信号来检测BCR
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ABL1 P210型融合基因b2a2和b3a2的表达，从而获得BCR
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ABL1 P210型融合基因b2a2、b3a2和ABL
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WT拷贝数含量和突变基因丰度作为其量值。2.根据权利要求1所述的BCR
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ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)和步骤(4)中，在配置一定浓度的RNA储存缓冲溶液以及标准品溶液时，采用天平称量法进行称量稀释混合。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：董莲华，杨怡，王霞，
申请(专利权)人：深圳中国计量科学研究院技术创新研究院，
类型：发明
国别省市：