一种提升丝状真菌蛋白分泌能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高曲霉蛋白分泌能力的方法及获得的重组菌株。所述方法包括对曲霉进行遗传操作以缺失或降低特定基因An16g07795的活性，以提高其糖化酶、α

【技术实现步骤摘要】
一种提升丝状真菌蛋白分泌能力的方法


[0001]本专利技术属于基因工程和生物
具体地，本专利技术涉及一种提高曲霉蛋白分泌能力的方法，具体涉及曲霉的遗传改造，更具体的涉及对曲霉基因组进行特定基因的缺失编辑。

技术介绍

[0002]糖化酶（Glucoamylase，EC 3.2.1.3）全称为葡萄糖淀粉酶，是一种外切水解酶，能够以淀粉或其他相关多糖为底物，从非还原端水解α
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1,4糖苷键逐个释放出单个β
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D
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葡萄糖，同时也能水解α
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1,6糖苷键和α
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1,3糖苷键。糖化酶是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类，是工业酶制剂中最重要的酶类之一，广泛应用于啤酒、味精、淀粉糖、抗菌素等要求淀粉最大限度转化为葡萄糖的工业领域。
[0003]丝状真菌例如黑曲霉（Aspergillus niger）和米曲霉（Aspergillus oryzae）和里氏木霉（Trichoderma reesei）是工业蛋白质最主要的生产宿主之一，因其具有强大的蛋白质分泌能力和良好的安全性被广泛用于多种酶制剂的生产。糖化酶的主要生产菌种为丝状真菌，来源于曲霉属（Aspergillus）和根霉属（Rhizopus）。我国糖化酶主要是由黑曲霉优良菌种经深层发酵精制提炼而成。我国糖化酶行业经过几十年来科研工作者的不懈努力和不断发展，目前已经可以自主生产糖化酶等大宗酶制剂品种。例如中国专利CN 102827817 B公布了一种耐热糖化酶GAI 及其基因和应用，通过筛选出耐热糖化酶或克隆表达耐热糖化酶基因，提高糖化酶的作用温度，会使淀粉糖化过程像淀粉液化那样在短时间内完成；专利号为CN 113061539 A的专利技术专利公开了一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株，通过脂肪酸代谢途径的调控大大提高了黑曲霉的糖化酶生产能力。CN105255741 A公布了一株以黑曲霉G131和F285为出发菌株，通过多轮原生质体电融合育种选育获得的高产糖化酶的菌株
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黑曲霉CGMCC 10788，该菌株平均发酵酶活力可达到87000
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90000u/mL，比出发菌株提高了99.3％。
[0004]尽管这些研究也已经达到了很高的水平，但是目前的研究主要集中在利用传统的方法进行耐热糖化酶筛选和克隆表达，或者是利用传统的菌种选育方法进行高产糖化酶菌株的筛选育种，或者是转录调控提高糖化酶基因的表达水平。蛋白质合成分泌涉及转录表达调控，翻译后折叠修饰，以及转运分泌出细胞膜等多个的系统协同作用，是一个非常复杂的过程。所以还需要我们进一步了解蛋白分泌途径，减轻甚至消除分泌途径的瓶颈，进一步提升丝状真菌蛋白分泌能力。
[0005]高分泌型丝状真菌宿主在生产蛋白质具有很大的潜力。因此，有必要开发一种通过改造分泌途径来提高丝状真菌蛋白分泌能力的方法，并利用基因编辑技术获得糖化酶等淀粉水解酶分泌水平显著提高的重组菌株，从而降低传统筛选育种所需耗费大量时间和劳动成本，以满足我国糖化酶在工业领域进行发酵应用，具有重要的创新性。

技术实现思路

[0006]本专利技术人经过广泛的基因筛选及深入的研究，发现将曲霉中的基因An16g07795进行敲除编辑能够大大提高其蛋白分泌水平。因此，本专利技术的目的在于提供一种能够提高丝状真菌蛋白分泌能力和淀粉酶生产能力的菌种改造方法，是通过遗传改造丝状真菌蛋白分泌途径相关基因来提高丝状真菌蛋白分泌水能力和淀粉酶产量。
[0007]为此，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种提高曲霉（Aspergillus）蛋白分泌水平的重组菌株构建的方法，其特征在于，是将曲霉中的基因An16g07795失活或降低，以提高其分泌蛋白质的能力。
[0008]具体地，所述基因An16g07795的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因An16g07795的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]在具体实施方式中，将所述An16g07795基因失活或降低是通过对其基因表达盒完全或部分缺失、通过插入失活或通过使得基因相对于它的预期目的无功能化的手段以阻止所述基因表达功能蛋白，或者降低功能蛋白的表达；优选地，通过遗传操作使曲霉细胞中的基因An16g07795被敲除。
[0010]优选地，所述曲霉是黑曲霉（Aspergillus niger）。
[0011]在具体实施方式中，所述提高的分泌蛋白质是指参与淀粉水解的蛋白质。更具体地，所述蛋白质是糖化酶和/或α
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淀粉酶。
[0012]本专利技术因此还提供通过所述的方法得到的重组菌株。
[0013]本专利技术进一步提供利用所述的重组菌株表达淀粉水解的蛋白质的方法，其特征在于在淀粉原料或淀粉诱导物存在下，培养所述的重组菌株，以获得淀粉水解的蛋白质，优选是糖化酶和/或α
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淀粉酶；进一步地，包括分离所述淀粉水解的蛋白质的步骤。
[0014]本专利技术还提供利用所述的重组菌株水解淀粉的方法，其特征在于，在淀粉原料或淀粉诱导物存在下，培养所述重组菌株，从而水解淀粉。
[0015]在具体实施例中，本专利技术分别对两株黑曲霉菌株（CBS513.88和糖化酶工业生产菌株N1）进行基因敲除获得的基因编辑突变菌。具体地，所述的构建方法，包括如下步骤：构建2个针对靶向基因An16g07795的引导RNA（sgRNA）表达元件，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3所示（AnU6p
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An16g07795
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sgRNA
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1）和SEQ ID NO.4所示（AnU6p
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An16g07795
‑
sgRNA
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2）；构建含有G418抗性标记的基因An16g07795的同源供体DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示（donor
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An16g07795）。将Cas9蛋白的表达框，AnU6p
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An16g07795
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sgRNA
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1和AnU6p
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An16g07795
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sgRNA
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2以及供体DNA donor
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An16g07795共转化进入两个宿主菌株的原生质体细胞后，通过同源重组能获得基因编辑突变株,所述的重组菌株分别命名为CBS
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ΔAn16g07795和N1
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ΔAn16g07795的基因突变菌株，其是敲除了基因An16g07795的曲霉菌株。
[0016]在本专利技术中，对所用术语的含义作一说明。
[0017]“重组”被用于指代菌株、细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该菌株、细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。例如，重组菌株是表达在天然（非重组）形式的该菌株中不曾发现的基因，或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高曲霉（Aspergillus）蛋白分泌水平的重组菌株构建的方法，其特征在于，是将曲霉中的基因An16g07795失活或降低，以提高其分泌蛋白质的能力。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因An16g07795的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因An16g07795的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述An16g07795基因失活或降低是通过对其基因表达盒完全或部分缺失、通过插入失活或通过使得基因相对于它的预期目的无功能化的手段以阻止所述基因表达功能蛋白，或者降低功能蛋白的表达；优选地，通过遗传操作使曲霉细胞中的基因An16g07795被敲除。5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：马延和，田朝光，王兴吉，刘倩，刘音，刘丹丹，杨玉净，郭文柱，孙涛，孙文良，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：