成年鼠脑组织单细胞悬液的制备方法及试剂盒技术

本发明专利技术实施例提供一种成年鼠脑组织单细胞悬液的制备方法，包括：配制木瓜蛋白酶活化剂；配制酶解体系；将木瓜蛋白酶活化剂、酶解体系和成年鼠脑组织装入容器中进行自动化酶解处理，得到单细胞悬液；对单细胞悬液进行后处理。本发明专利技术实施例将木瓜蛋白酶活化剂和酶解体系配合自动化酶解处理制备得到成年鼠脑组织单细胞悬液，酶解体系中除了包含木瓜蛋白酶，还包含低浓度的中性蛋白酶（0.6

【技术实现步骤摘要】
成年鼠脑组织单细胞悬液的制备方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于细胞分子生物学的
，尤其涉及一种成年鼠脑组织单细胞悬液的制备方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]随着细胞分子生物学的发展，流式细胞分析，单细胞测序等技术的出现，极大的丰富了细胞分子层面的手段，也大大增加了生物学家从组织中制备单细胞悬液的需求。其所获得产物的质量，如单细胞悬液中细胞浓度、细胞活性以及细胞表位完整性将对后续的实验有着决定性的影响。制备具有高细胞活力和最小细胞碎片的单细胞悬液是细胞分析的先决条件，也是下游实验成败的关键之一。
[0003]目前，脑组织中的神经胶质细胞，如小胶质细胞和星形胶质细胞，在脑损伤和神经炎症中起关键作用，这些神经胶质细胞的激活以及中枢神经系统中的白细胞浸润有助于调节许多神经病理学中的神经元存活。小胶质细胞作为大脑的主要免疫活性细胞，在神经保护和神经退行性变中发挥着重要作用。因此，它们是众多中枢神经系统疾病研究的重点。而大脑分离的要求取决于细胞类型和动物年龄，尤其在成年鼠的大脑中，需要复杂的机械和酶的处理才能成功地分解紧密相连的神经细胞。在单细胞悬液的制备方法中，手工酶解法具有制得单细胞损伤较小，细胞形态规则，具有特异酶解作用等诸多优点，因此为目前将组织分散成单个细胞试验中最为常用的方法。现有的成年鼠脑组织单细胞悬液的制备大多采用手工酶解法，即利用 木瓜蛋白酶、胶原酶II和分散酶II等酶进行手工酶解处理。
[0004]在实际的单细胞悬液制备过程中，利用手工酶解法制备得到的单细胞悬液的质量取决于实验人员的操作熟练程度。如果操作不熟练反而会出现细胞损伤较大的问题。而且手工酶解处理过程操作繁琐，很难保证单细胞悬液中的细胞产量、细胞浓度和细胞表位完整性的一致性，从而影响下游实验的可重复性。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种成年鼠脑组织单细胞悬液的制备方法，旨在解决现有的手工酶解法无法保证制备得到的单细胞悬液中的细胞产量、细胞浓度和细胞表位完整性的一致性的问题。
[0006]第一方面，提供一种成年鼠脑组织单细胞悬液的制备方法，包括：S1：配制木瓜蛋白酶活化剂；S2：配制酶解体系，酶解体系包括0.5
‑
2mg/mL的木瓜蛋白酶、0.6
‑
2.0U/mL的Dispase II和0.1
‑
1.0mg/mL的DNase I；S3：将木瓜蛋白酶活化剂、酶解体系和成年鼠脑组织装入容器中进行自动化酶解处理，得到单细胞悬液；S4：对单细胞悬液进行后处理。
[0007]第二方面，提供一种试剂盒，包括木瓜蛋白酶活化剂和酶解体系；
酶解体系包括0.5
‑
2mg/mL的木瓜蛋白酶、0.6
‑
2.0U/mL的Dispase II和0.1
‑
1.0mg/mL的DNase I。
[0008]本专利技术实施例将木瓜蛋白酶活化剂和酶解体系配合自动化酶解处理制备得到成年鼠脑组织单细胞悬液，酶解体系中除了包含木瓜蛋白酶，还包含低浓度的中性蛋白酶（0.6
‑
2.0U/mL的Dispase II），在有效分离出神经胶质细胞的同时，减少了细胞表位破坏和细胞活率损伤，提高了细胞浓度，自动化的酶解处理保证了单细胞悬液中的细胞产量、细胞浓度和细胞表位完整性的一致性，进而保证下游实验的可重复性。
附图说明
[0009]图1是本专利技术实施例一提供的成年鼠脑组织单细胞悬液制备方法的流程图；图2是本专利技术实施例一提供的自动化酶解处理的流程图；图3是本专利技术实施例一提供的去髓鞘和细胞碎片的流程图；图4是手工酶解法处理成年鼠脑组织（脑组织质量小于800mg）得到的单细胞悬液的显微镜图；图5是本专利技术实施例一提供的制备方法处理成年鼠脑组织（脑组织质量小于800mg）得到的单细胞悬液的显微镜图；图6是本专利技术实施例一提供的制备方法处理成年鼠脑组织（脑组织质量小于800mg）得到的单细胞悬液去髓鞘和细胞碎片前后的细胞流式图对比；图7是本专利技术实施例一提供的制备方法处理成年鼠脑组织（脑组织质量小于800mg）得到的单细胞悬液中能检测出小胶质细胞的细胞流式图；图8是本专利技术实施例一提供的制备方法处理成年鼠脑组织（脑组织质量小于800mg）得到的单细胞悬液中能检测出星形胶质细胞的细胞流式图；图9是手工酶解法处理成年鼠脑组织（脑组织质量大于等于800mg并且小于1500mg）得到的单细胞悬液的显微镜图；图10是本专利技术实施例一提供的制备方法处理成年鼠脑组织（脑组织质量大于等于800mg并且小于1500mg）得到的单细胞悬液的显微镜图。
具体实施方式
[0010]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0011]本专利技术实施例将木瓜蛋白酶活化剂和酶解体系配合自动化的酶解处理制备得到成年鼠脑组织单细胞悬液，酶解体系中除了包含木瓜蛋白酶，还包含低浓度的中性蛋白酶（0.6
‑
2.0U/mL的Dispase II），在有效分离出神经胶质细胞的同时，减少了细胞表位破坏和细胞活率损伤，提高了细胞浓度，自动化的酶解处理保证了单细胞悬液中的细胞产量、细胞浓度和细胞表位完整性的一致性，进而保证下游实验的可重复性。
[0012]实施例一图1是本专利技术实施例一提供的成年鼠脑组织单细胞悬液制备方法的流程图。如图1所示，包括如下步骤：
S1：配制木瓜蛋白酶活化剂。
[0013]在本专利技术实施例中，木瓜蛋白酶活化剂包括含钙镁离子的伊格尔平衡盐溶液（Earle's Balanced Salt Solution，EBSS）缓冲液、2.5
‑
5mM的乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA
‑
Na2）和3
‑
8mM的L
‑
半胱氨酸盐酸盐。即含钙镁离子的EBSS缓冲液作为溶剂，在其中加入2.5
‑
5mM EDTA
‑
Na2和3
‑
8mM的L
‑
半胱氨酸盐酸盐。配制简单易保存，可做成试剂盒。优选地，木瓜蛋白酶活化剂还包括10
‑
20mM的4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸（Hydroxyethyl piperazine ethyl sulfonic acid，HEPES）HEPES。HEPES能增强溶液的pH值缓冲能力，增强木瓜蛋白酶活化剂的稳定性。此外，通过调节EDTA和L
‑
半胱氨酸的浓度，可在15min内快速充分活化S2中的木瓜蛋白酶，缩短了木瓜蛋白酶的活化时间。
[0014]本专利技术实施例的木瓜蛋白酶活化剂不包含常规木瓜蛋白酶活化剂中常用的β
‑
巯基乙醇（β
‑
巯基乙醇为有刺激气味并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.成年鼠脑组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括：S1：配制木瓜蛋白酶活化剂；S2：配制酶解体系，所述酶解体系包括0.5
‑
2mg/mL的木瓜蛋白酶、0.6
‑
2.0U/mL的Dispase II和0.1
‑
1.0mg/mL的DNase I；S3：将所述木瓜蛋白酶活化剂、所述酶解体系和成年鼠脑组织装入容器中进行自动化酶解处理，得到单细胞悬液；S4：对所述单细胞悬液进行后处理。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶活化剂包括含钙镁离子的伊格尔平衡盐溶液EBSS缓冲液、2.5
‑
5mM的乙二胺四乙酸二钠EDTA
‑
Na2和3
‑
8mM的L
‑
半胱氨酸盐酸盐。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶活化剂还包括10
‑
20mM的4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3的自动化酶解处理包括：S31：在37摄氏度下保温15分钟；S32：在37摄氏度、转速为30转/分钟条件下逆时针旋转4分钟；S33：在转速为300转/分钟条件下顺时针旋转30秒；S34：在转速为100转/分钟条件下顺时针旋转30秒；S32、S33和S34循环执行N次，N为大于等于1的正整数。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括：S5：去髓鞘和细胞碎片。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，S5包括：S51：配制去碎片储存液，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖艳归，郭燕珊，
申请(专利权)人：深圳市瑞沃德生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：