一种突变型Taq酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种突变型Taq酶及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的突变型Taq酶为将野生型Taq酶氨基酸序列的第177位天冬氨酸突变为谷氨酸，第180位丙氨酸突变为缬氨酸，第626位谷氨酸突变为赖氨酸，第661位丙氨酸突变为谷氨酸，第665位异亮氨酸突变为苏氨酸，第667位苯丙氨酸突变为亮氨酸。本发明专利技术提供的突变型Taq DNA聚合酶活性和热稳定性均提高，该突变型Taq DNA聚合酶可以满足各种科研、临床和工业应用需求。业应用需求。

【技术实现步骤摘要】
一种突变型Taq酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种突变型Taq酶及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌中分离出来的一种热稳定聚合酶，该酶属于DNA聚合酶I家族，该酶基因编码区核苷酸序列为2496个碱基，编码832个氨基酸，是分子量为94KD的热稳定碱性蛋白，具有DNA结合能力。随着PCR技术的推广和应用，对Taq DNA聚合酶的研究越来越重要。原有的野生型Taq DNA聚合酶已经不能满足PCR技术的要求，因此需要对天然Taq DNA聚合酶进行改造，以适应科研及工业生产要求。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种突变型Taq酶及其制备方法与应用。
[0004]第一方面，本专利技术要求保护一种突变型Taq酶。
[0005]本专利技术所要求保护的突变型Taq酶为将野生型Taq酶的氨基酸序列的第177位天冬氨酸突变为谷氨酸，第180位丙氨酸突变为缬氨酸，第626位谷氨酸突变为赖氨酸，第661位丙氨酸突变为谷氨酸，第665位异亮氨酸突变为苏氨酸，第667位苯丙氨酸突变为亮氨酸。进一步地，所述突变型Taq酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0006]第二方面，本专利技术要求保护能够表达前文第一方面中所述的突变型Taq酶的核酸分子。
[0007]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。
[0008]进一步地，所述核酸分子可为如下任一：
[0009](A1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
[0010](A2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述突变型Taq酶的DNA分子；
[0011](A3)与(B1)
‑
(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述突变型Taq酶的DNA分子。
[0012]上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1
×
SSC，0.1％ SDS中漂洗；也可为：在6
×
SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2
×
SSC，0.1％ SDS和1
×
SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。
[0013]上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源
性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0014]上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
[0015]第三方面，本专利技术要求保护含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
[0016]所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述核酸分子(即所述突变型Taq酶的编码基因)的DNA，该DNA不但可包括启动所述编码基因转录的启动子，还可包括终止所述编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0017]上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0018]上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)(如根癌农杆菌EHA105)，黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。
[0019]在本专利技术的具体实施方式中，所述重组载体为将所述核酸分子克隆到pET
‑
28a载体的多克隆位点后所得。
[0020]进一步地，所述重组微生物为将前文所述的重组载体导入到大肠杆菌后所得。
[0021]在本专利技术的具体实施方式中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
[0022]第四方面，本专利技术要求保护一种制备前文第一方面中所述突变型Taq酶的方法。
[0023]本专利技术要求保护的制备前文第一方面中所述突变型Taq酶的方法，可包括如下步骤：
[0024](B1)构建含有前文第二方面中所述核酸分子的表达载体；
[0025](B2)将步骤(B1)的表达载体转化至宿主细胞，获得重组细胞；
[0026](B3)培养步骤(B2)的重组细胞，诱导表达重组蛋白，纯化得到所述突变型Taq酶。
[0027]其中，步骤(B1)可以采用先合成编码上述突变型Taq酶的核酸分子，再将所述核酸分子插入到合适的表达载体中，也可通过PCR直接得到包含突变型Taq酶编码基因的质粒。在本专利技术的一个实施例中，用包含天然Taq DNA聚合酶(野生型Taq DNA聚合酶)基因的质粒做模板，进行PCR扩增。合成的扩增引物(突变引物)包含了需要突变的位点，且已经替换掉所需要的突变碱基。扩增后消化原来的模板，再将PCR产物即含有突变后Taq DNA聚合酶基因的质粒。
[0028]进一步地，在(B1)中，所述表达载体为原核表达载体。在本专利技术的具体实施方式中，所述重组载体为将所述核酸分子克隆到pET
‑
28a载体的多克隆位点后所得。
[0029]在(B2)和(B3)中，在适当条件下培养含有上述突变型Taq DNA聚合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变型Taq酶，其特征在于：所述突变型Taq酶为将野生型Taq酶的氨基酸序列的第177位天冬氨酸突变为谷氨酸，第180位的丙氨酸突变为缬氨酸，第626位谷氨酸突变为赖氨酸，第661位丙氨酸突变为谷氨酸，第665位异亮氨酸突变为苏氨酸，第667位苯丙氨酸突变为亮氨酸后所得。2.根据权利要求1所述的突变型Taq酶，其特征在于：所述突变型Taq酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。3.能够表达权利要求1或2所述的突变型Taq酶的核酸分子。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下任一：(A1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；(A2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述突变型Taq酶的DNA分子；(A3)与(B1)
‑
(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述突变型Taq酶的DNA分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：张帆，贾泽川，
申请(专利权)人：简石生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：