本发明专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas13a系统特异性靶向IDH1R132H基因的crRNA及应用，crRNA序列如SEQ ID NO：14所示，所述crRNA特异性靶向IDH1R132H基因。本发明专利技术提出的一种基于CRISPR/Cas13a基因编辑系统靶向胶质瘤关键变异基因IDH1R132H实现了在体分子诊断且发现了其具有抑制颅内肿瘤形成的作用。另外，本发明专利技术将报告RNA与CRISPR/Cas13a系统整合实现了高灵敏诊断。灵敏诊断。灵敏诊断。
【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas13a系统特异性靶向IDH1 R132H基因的crRNA及应用
[0001]本专利技术属于基因检测领域，尤其是涉及一种基于CRISPR/Cas13a系统特异性靶向IDH1 R132H基因的crRNA及应用。
技术介绍
[0002]基于CRISPR/Cas的生物检测的优势之处在于可特异性识别RNA并启动核酸酶活性。检测目标RNA的特异性是通过设计CRISPR RNA(crRNA)序列与目标RNA序列互补实现的。在识别并结合目标RNA到crRNA后，CRISPR/Cas13a的单链RNA(ssRNA)裂解能力被激活。CRISPR/Cas13a可以辨别单碱基错配，体现了该系统显著的感应精度。现在迫切需要超灵敏和低成本的RNA诊断，因为即时和准确检测RNA可以有效监测和控制传染病的爆发以及早期检测其他病理情况，包括癌症。当Cas13a正确与靶向RNA序列结合以后，其非特异性切割的特性便会被激活，进而切割体系中荧光报告基因，实现待检序列信息从荧光信号的转化。基于Cas13a的诊断法已被有效地应用于检测A型禽流感(H7N9)病毒、埃博拉病毒、乙肝病毒(HBV)、SARS
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CoV
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2和miRNA。由此可见，CRISPR/Cas13a系统作为一种快速检测核酸的诊断工具，能用于肿瘤相关疾病的早期诊断，具有低成本和易于开展使用的优点，并且耗时短、灵敏度高，在多重靶分子的检测中亦有巨大的潜力。
[0003]目前，IDH1/2突变被认为是胶质瘤发病的最早事件，也是胶质瘤生物学中最重要的基因改变之一。开发一种高灵敏度、精确和便捷的检测胶质瘤RNA的新方法不仅有利于胶质瘤研究，而且也可以作为胶质瘤的诊断工具。
技术实现思路
[0004]有鉴于此，本专利技术旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于CRISPR/Cas13a系统特异性靶向IDH1 R132H基因的crRNA及应用。
[0005]为达到上述目的，本专利技术创造的技术方案是这样实现的：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种特异性靶向胶质瘤的crRNA，其序列如SEQ IDNO：14所示，所述crRNA特异性靶向IDH1 R132H基因。
[0007]第二方面，本专利技术提供了一种CRISPR/Cas13a基因编辑系统，包括上述特异性靶向胶质瘤的crRNA。
[0008]优选地，所述CRISPR
‑
Cas13a基因编辑系统还包括Cas13a蛋白和报告RNA，所述报告RNA包含有多个连续碱基U以及荧光基团和淬灭基团的单链RNA。
[0009]优选地，所述报告RNA的序列为：5
′‑
FAM
‑
UUUUUUUUUUUUUUUUUUUU
‑
BHQ
‑3′
。
[0010]第三方面，本专利技术提供了一种上述CRISPR/Cas13a基因编辑系统在制备诊断胶质瘤试剂中的应用。
[0011]第四方面，本专利技术提供了一种上述CRISPR/Cas13a基因编辑系统在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
[0012]相对于现有技术，本专利技术具有以下优势：
[0013]本专利技术提出的一种基于CRISPR/Cas13a基因编辑系统靶向胶质瘤关键变异基因IDH1 R132H实现了在体分子诊断且发现了其具有抑制颅内肿瘤形成的作用。另外，本专利技术将报告RNA与CRISPR/Cas系统整合实现了高灵敏诊断。
附图说明
[0014]图1为实施例6的Cas13a
‑
crRNA14触发旁效应图(图1A为在Agilent 2100上测定的RNA完整值；图1B为在Agilent 2100上测定的28S:18S比率)；
[0015]图2为实施例8的流式细胞仪检测转染不同长度报告RNA后的荧光变化图；
[0016]图3为cRGD
‑
PP载体与质粒DNA凝胶迟滞试验结果；
[0017]图4为实施例11的裸鼠大脑的cy5.5荧光和生物发光图像(图4A为含有IDH1突变的活体裸鼠大脑的cy5.5荧光和生物发光图像，图4B为含有IDH1突变的活体裸鼠大脑的cy5.5荧光和生物发光统计结果；图4C为含有IDH1突变的离体裸鼠大脑的cy5.5荧光和生物发光图像，图4D为含有IDH1突变的离体裸鼠大脑的cy5.5荧光和生物发光图像统计结果；图4E为含有FGFR3
‑
TACC3融合突变的活体裸鼠大脑的cy5.5荧光和生物发光图像，图4F为含有FGFR3
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TACC3融合突变的活体裸鼠大脑的cy5.5荧光和生物发光的统计结果；图4G为含有FGFR3
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TACC3融合突变的离体裸鼠大脑的cy5.5荧光和生物发光图像，图4H为含有FGFR3
‑
TACC3融合突变的离体裸鼠大脑的cy5.5荧光和生物发光统计结果)；
[0018]图5为实施例11的CRISPR
‑
Cas13a系统的瘤内递送抑制颅内肿瘤的形成结果图(图5A为在植入后第7、14和21天拍摄植入IDH1颅内肿瘤的小鼠的代表性生物发光图像；图5B为在植入后第7、14和21天拍摄植入IDH1颅内肿瘤的小鼠的代表性量化信号强度；图5C为在植入后第7、14和21天拍摄植入FGFR3
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TACC3颅内肿瘤的小鼠的代表性生物发光图像；图5D为在植入后第7、14和21天拍摄植入FGFR3
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TACC3颅内肿瘤的小鼠的代表性量化信号强度)；
[0019]图6为实施例11的小鼠生存曲线图(图6A为含有IDH1突变的的小鼠生存曲线；图6B为含有FGFR3
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TACC3融合突变的的小鼠生存曲线)；
[0020]图7为实施例11的处死小鼠染色和免疫组织化学分析结果图(图7A为含有IDH1突变的颅内肿瘤小鼠H&E染色代表性图像；图7B为含有FGFR3
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TACC3突变的颅内肿瘤小鼠H&E染色代表性图像；图7C为含有IDH1突变的颅内肿瘤小鼠免疫组化染色代表性图像；图7D为含有FGFR3
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TACC3突变的颅内肿瘤小鼠免疫组化染色代表性图像；图7E为含有IDH1突变的颅内肿瘤小鼠免疫染色组织学分析统计结果；图7F为含有FGFR3
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TACC3突变的颅内肿瘤小鼠免疫染色组织学分析统计结果)。
具体实施方式
[0021]除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0022]下面结合实施例来详细说明本专利技术。
[0023]实施例1crRNA的设计
[0024]遵循叠瓦状的设计原则，设计靶向特异性片段的crRNA文库，共包含29个crRNA：...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种特异性靶向胶质瘤的crRNA，其特征在于：其序列如SEQID NO：14所示，所述crRNA特异性靶向IDH1 R132H基因。2.一种CRISPR/Cas13a基因编辑系统，其特征在于：包括上述特异性靶向胶质瘤的crRNA。3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas13a基因编辑系统，其特征在于：所述CRISPR/Cas13a基因编辑系统还包括Cas13a蛋白和报告RNA，所述报告RNA包含有多个连续碱基U以及荧光基团和淬灭基团的单链RNA。4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas...
【专利技术属性】
技术研发人员：康春生，武烨，王蕴菲，周俊虎，王琦雪，
申请(专利权)人：天津医科大学总医院，
类型：发明
国别省市：
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