一种确定PCR扩增循环数的方法技术

一种确定PCR扩增循环数的方法，包括按如下公式确定样本的PCR扩增循环数，扩增循环数y＝DV200*(

【技术实现步骤摘要】
一种确定PCR扩增循环数的方法


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种确定PCR扩增循环数的方法。

技术介绍

[0002]随着人口的老龄化和快速增长，全球的癌症发病数和死亡数也正在快速增长。为了使肿瘤治疗的效益最大化和毒性最小化，靶向治疗已成为癌症控制的主要方式之一，并对一些癌症取得了令人印象深刻的结果。这些靶点要么是表面标记物，如人上皮受体2(HER2)(曲妥珠单抗靶向)。或内部标识，如BRAF V600E突变(维罗非尼靶向)和EML4
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ALK融合(克唑替尼靶向)。
[0003]融合基因是由结构染色体重排(主要包括易位、倒置、扩增和缺失)或由顺式和反式剪接或转录读通引起的非结构畸变形成的。据估计，基因融合导致了全球20％的癌症发病率。研究表明这些事件在肿瘤发生的初始步骤中起重要作用。典型结构融合是肿瘤细胞的特征，是癌症细胞识别和/或靶向的理想标记物，如NTRK融合。这为缺乏表面标记的肿瘤提供了特别的好处，如占所有乳腺癌病例15
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20％的三阴性乳腺癌，仍然缺乏有效的靶向治疗。此外，融合基因可以提供良好的预后和/或预测价值。例如，ETV6
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RUNX1是最常见的遗传异常，约占儿童急性淋巴细胞白血病中所有前体B细胞淋巴细胞白血病病例的25％。ETV6
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RUNX1被认为是预后良好的独立预测因子，这种融合的患者复发率相对较低。
[0004]1960年人类癌症中第一个融合基因的证据被确定，至今已经发现了超过10,000个基因融合。并且随着对更多癌症排序的深入研究以及对技术和生物信息检测方法的改进，这个列表还在继续增长。传统细胞遗传学中的染色体分带技术和分子细胞遗传学中的荧光原位杂交(FI SH)、基因融合微阵列和PCR/RT
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PCR方法是用于检测融合事件的首批临床诊断分析方法。然而，这些方法的分辨率通常较低，复杂的重排通常不容易检测到。尽管细胞遗传学和FISH方法仍然是血液病和实体肿瘤融合基因诊断不可或缺的工具，但大规模基因组序列研究最近通过一系列技术方法，如全基因组测序、靶向杂交捕获和RNA测序(RNA
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seq)，同时还开发了许多不同的生物信息学管道，揭示了癌症中大量的其他基因融合。其中RNA
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Seq作为一种无偏见的工具有助于融合基因的发现和检出，对于临床样本的融合检出有广泛的运用前景。
[0005]RNA
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seq(全转录组测序)一般的建库流程为从肿瘤组织中提取RNA，质控合格后进行rRNA去除、打断、一链合成、使用dUTP进行二链合成后形成双链DNA，通过打断、末端修复、加A碱基、加接头、去除含U链、PCR扩增等步骤制备链特异性文库，文库质控合格后进行上机测序。其中PCR扩增不仅引入了index(样本标签)，使同一个测序反应中对多个样品进行池化(pooling)和测序成为可能，同时还对dup rate(重复序列在总测序序列中的占比，即重复率)有一定的影响。PCR循环数过低会导致文库浓度偏低，无法满足正常上机要求；PCR循环数过高，会导致dup rate偏高，影响下机QC(Quality control)数据。所以合适的PCR扩增循环数显得尤为重要。目前为了确定合理的PCR循环数，大多数实验室最常用的方法是根据RT
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PCR的CT值确定PCR的循环数。因为CT值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值
时所经历的循环数，该数值表明管内的模板得到了充分但未过量的扩增，对文库PCR的扩增循环数有一定的参考价值。但是这种方法会增加一步RT
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PCR的步骤，不仅会延长整体的实验时长，还需要使用相应的物料，造成实验成本偏高。同时根据数据统计(见表1)，该方法并不能避免过量扩增和非充分扩增的发生，同时过量扩增还增加了dup rate偏高的风险。
[0006]表1 RT
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PCR确定循环数方法文库浓度统计
[0007]文库浓度范围(ng/μL)数量占比>54.17％(5/120)5
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2030.83％(37/120)20
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4023.33％(28/120)40
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6011.67％(14/120)>6030％(36/120)

技术实现思路

[0008]根据第一方面，在一实施例中，提供一种确定PCR扩增循环数的方法，包括按如下公式确定样本的PCR扩增循环数：
[0009]扩增循环数y＝DV200*(
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4.5223)+lg(RNA起始投入量)*(
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3.5)+K；
[0010]K为26.7821或28.7821；
[0011]所述扩增循环数y以四舍五入的方式取整数。
[0012]根据第二方面，在一实施例中，提供一种文库构建方法，包括：
[0013]扩增步骤，包括按照第一方面任意一项的方法所确定的循环数，对预处理的样本进行PCR扩增，获得扩增后的样本，即为所述文库。
[0014]依据上述实施例的一种确定PCR扩增循环数的方法，本专利技术有效降低了过量扩增的概率，使得大量的样本都可以处在合理的文库浓度区间下。
附图说明
[0015]图1为DV200、RIN值和Mapped reads(比对到参考基因组的reads)的关系图；
[0016]图2为229026662FR
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labchip结果；
[0017]图3为220020961CR
‑
labchip结果；
[0018]图4为220021353FR
‑
labchip结果；
[0019]图5为220011551CR
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labchip结果；
[0020]图6为229026661FR
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labchip结果；
[0021]图7为229026660FR
‑
labchip结果。
具体实施方式
[0022]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操
作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0023]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种确定PCR扩增循环数的方法，其特征在于，包括按如下公式确定样本的PCR扩增循环数：扩增循环数y＝DV200*(
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4.5223)+lg(RNA起始投入量)*(
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3.5)+K；K为26.7821或28.7821；所述扩增循环数y以四舍五入的方式取整数。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当样本中RNA的DV200>20％时，扩增循环数y＝DV200*(
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4.5223)+lg(RNA起始投入量)*(
‑
3.5)+26.7821，所述扩增循环数y以四舍五入的方式取整数；当样本中RNA的DV200≤20％时，扩增循环数y＝DV200*(
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4.5223)+lg(RNA起始投入量)*(
‑
3.5)+28.7821，所述扩增循环数y以四舍五入的方式取整数。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增后，如果样本中的文库浓度X≤12ng/μL，则进行再次扩增。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增后，如果样本中的文库浓度X＞12ng/μL，则不进行再次扩增。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增后，如果样本中的文库浓度X为0≤X<3ng/μL，再次扩增的循环...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓琪，冀少卿，李奇，施玉健，邱顺芳，魏梦辉，陈欣，
申请(专利权)人：北京吉因加科技有限公司上海吉因加医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：