本发明专利技术涉及一种利用CD79b单克隆抗体诱导构建体外B细胞免疫无能模型及其构建方法，分离患者生物样品，并进一步利用磁珠分选法分离得到初始B细胞；利用CD79b单克隆抗体体外培养初始B细胞，通过调控B细胞表面IgM内化，诱导成为免疫无能B细胞模型。本发明专利技术的模型可以实现降低初始B细胞表面IgM和活化分子CD86的表达，降低BCR刺激后细胞内钙离子内流水平和磷酸化水平，从而抑制B细胞的活化和分化，可作为体外研究免疫耐受的模型和方法。研究免疫耐受的模型和方法。研究免疫耐受的模型和方法。
【技术实现步骤摘要】
一种利用CD79b单克隆抗体诱导构建B细胞免疫无能模型及其构建方法
[0001]本专利技术属于细胞免疫学的研究方法领域，特别涉及一种利用CD79b单克隆抗体诱导构B细胞的免疫无能模型及其构建方法。
技术介绍
[0002]系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病，以B细胞免疫耐受破坏、产生大量自身抗体为特征，最终引起免疫复合物沉积于组织、器官从而导致损伤。SLE发病的中心环节表现为自身反应性B细胞异常激活，产生大量针对细胞核、细胞浆以及细胞表面成分的致病性自身抗体。
[0003]SLE患者体内免疫耐受检查点缺陷是SLE发病的重要原因，体内新生B细胞有50％
‑
70％为自身反应性，这些自身反应性B细胞需通过中枢或外周机制达到免疫耐受。中枢机制主要为“受体编辑”和“克隆清除”，然而仍会有一些自身反应性B细胞成熟并逃逸至外周，这时又要经历“克隆无能”以达到免疫耐受。主要通过自身抗原和自身反应性B细胞受体(BCR)慢性结合，诱导BCR内化，而不发生免疫应答。SHP
‑
1、SHIP
‑
1、PTEN等一些抑制性分子也一定程度上维持其无反应状态。但是这种免疫耐受状态具有可逆性，一旦被激活即可分泌自身抗体，导致自身免疫疾病。近年来，多项研究表明SLE患者体内免疫耐受检查点缺陷，导致自身反应性B细胞得以存在，并进一步活化产生自身抗体。
[0004]目前，B细胞靶向治疗成为SLE的重要治疗手段。多种B细胞的靶向药物相继问世，包括CD20的利妥昔单抗、抗CD22的依帕珠单抗、阻断共刺激信号的阿巴西普单抗等。这些药物的成功问世给SLE患者带来了极大的福音。而这些药物多以B细胞清除治疗为主，清除致病性B细胞的同时，还常常影响有益的B细胞亚群，从而损害患者的体液免疫。通过诱导B细胞免疫无能可成为B细胞靶向治疗一种新的治疗方式。然而，目前尚无诱导B细胞免疫无能的模型及其构建方法。
技术实现思路
[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用CD79b单克隆抗体诱导构建B细胞免疫无能的模型及其构建方法，该模型可以实现降低初始B细胞表面IgM和活化分子CD86的表达，降低BCR刺激后细胞内钙离子内流水平和磷酸化水平，从而抑制B细胞的活化和分化，可作为体外研究免疫耐受的模型和方法。
[0006]本专利技术提供了一种利用CD79b单克隆抗体诱导构建B细胞免疫无能的模型，分离患者生物样品，并进一步利用磁珠分选法分离得到初始B细胞；利用CD79b单克隆抗体体外培养初始B细胞，通过调控B细胞表面IgM内化，诱导成为免疫无能B细胞模型。
[0007]所述生物样品为外周血、血清和/或外周血单个核细胞。
[0008]本专利技术还提供了一种利用CD79b单克隆抗体诱导构建体外B细胞免疫无能模型的构建方法，包括如下步骤：
[0009](1)收集患者生物样品，置于EDTA抗凝血采集管中，用密度梯度离心法分离；
[0010](2)进一步对上述生物样品利用磁珠分选法分离初始B细胞；
[0011](3)利用上述初始B细胞，流式验证分选纯度；重悬初始B细胞，得到细胞悬液；将细胞悬液加入到平底板中，加入CD79b单克隆抗体，放入37℃、5％CO2的孵箱，培养16
‑
24h，即得。
[0012]所述细胞悬液浓度为(5
‑
6)
×
105cells/ml。
[0013]所述CD79b单克隆抗体的加入量为5
‑
6ng/ml。
[0014]有益效果
[0015]本专利技术的模型可以实现降低初始B细胞表面IgM和活化分子CD86的表达，降低BCR刺激后细胞内钙离子内流水平和磷酸化水平，从而抑制B细胞的活化和分化，可作为体外研究免疫耐受的模型和方法，为诱导B细胞免疫耐受的治疗方法提供依据。相比于传统的B细胞清除治疗方法，诱导免疫耐受可避免B细胞的过度激活，可能更具安全和有效性，不损害机体的体液免疫。
附图说明
[0016]图1为CD79b单克隆抗体诱导SLE患者初始B细胞下调IgM，构建B细胞免疫耐受模型。**p＜0.01。
[0017]图2为CD79b单克隆抗体诱导构建的B细胞免疫无能模型相比对照组共刺激分子CD86表达下降。**p＜0.001。
[0018]图3为CD79b单克隆抗体诱导构建的B细胞免疫无能模型相比对照组钙离子内流水平下降。*p＜0.05。
[0019]图4为CD79b单克隆抗体诱导构建的B细胞免疫无能模型相比对照组胞内酪氨酸磷酸化水平下降。*p＜0.05。
[0020]图5为CD79b单克隆抗体通过调控细胞表面IgM内化诱导B细胞免疫无能。
具体实施方式
[0021]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0022]实施例1
[0023]本实施例通过密度梯度法分离SLE患者全血中单个核细胞(PBMC)，磁珠分选法分初始B细胞，利用CD79b单克隆抗体诱导B细胞免疫无能模型。进一步用流式抗体/分子标签标记B细胞IgM、CD86，钙离子和胞内酪氨酸磷酸化分子，用流式细胞仪检测CD79b诱导的免疫无能B细胞模型中IgM、CD86，钙离子和胞内磷酸化分子表达水平，评估B细胞的活化功能，具体内容如下：
[0024](一)实验方案
[0025](1)研究对象：在上海长征医院住院门诊系统纳入SLE患者12例。收集入组人员外周血样本。研究经上海长征医院伦理委员会批准，并获得之情同意。
[0026](2)病例组纳入标准：
①
年龄在18
‑
70岁之间。
②
参照2019 EULAR/ACR最新系统性红斑狼疮(SLE)分类标准。
③
自愿签署知情同意书。
[0027](3)病例组排除标准：
①
近3个月有感染病史；
②
妊娠和哺乳期女性；
③
明确肿瘤病史；
④
合并呼衰、心衰、急性心脑血管事件、肝肾损伤、精神疾病的SLE患者。
[0028](4)样本收集：本研究中，收集纳入所有人群外周血5ml，置于EDTA抗凝血采集管中，用密度梯度离心法分离PBMC。
[0029](5)磁珠法分选初始B细胞(CD19
+
CD27
‑
IgD
+
)：
①
用磁珠分选缓冲液重悬PBMC(5x107/ml)，将细胞悬液转移至无菌流式管中；
②
先后加入Cocktail Enhancer(50ul/ml)、Iso本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用CD79b单克隆抗体诱导构建B细胞免疫无能模型，其特征在于：分离患者生物样品，并进一步利用磁珠分选法分离得到初始B细胞；利用CD79b单克隆抗体体外培养初始B细胞，通过调控B细胞表面IgM内化，诱导成为B细胞实现免疫无能的模型。2.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于：所述生物样品为外周血、血清和/或外周血单个核细胞。3.一种利用CD79b单克隆抗体诱导构建B细胞免疫无能模型的方法，包括如下步骤：(1)收集患者生物样品，置于EDTA抗凝血采集管中，用密度梯度离心法分离；(2)进一步对上述生物样品利用磁珠...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘耀阳，康子健，张志国，孙宁霞，刘洋，徐沪济，
申请(专利权)人：上海长征医院，
类型：发明
国别省市：
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