一种春兰CgARF2基因在调控叶片生长发育中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种春兰CgARF2基因及其在调控叶片生长发育中的应用，CgARF2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术从春兰栽培品种“宋梅”中克隆获得CgARF2的基因序列，并在春兰中进行表达分析，随后将其构建至过表达载体导入目的植物中验证其功能，发现过表达CgARF2基因的拟南芥植株与野生型植株相比出现莲座叶数目增多、变小、叶边缘卷曲等表型，离体叶片在含有IAA的MS培养基上生根率提高、根长增加，叶片中内源激素IAA、GA含量增加，ABA、MeJA、BR含量降低，可见该基因在兰花及其它园艺植物的栽培和性状改良中将有广泛的用途。艺植物的栽培和性状改良中将有广泛的用途。艺植物的栽培和性状改良中将有广泛的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种春兰CgARF2基因在调控叶片生长发育中的应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种春兰CgARF2基因在调控叶片生长发育中的应用。

技术介绍

[0002]兰科（Orchidaceae）是开花植物中最大科之一，全世界有25000多种，约占所有开花植物的10%。春兰（Cymbidium goeringii）属于兰科兰属中的小花型地生兰种类，其花型奇特、花色淡雅，花香清幽，叶姿优美，观赏价值和经济价值极高，是典型的叶艺、花艺两全兰花。但近年来，该物种的过度挖掘和生态环境的恶化对春兰种子资源和生存环境的维护提出了较大的挑战。植物叶片是植物的重要器官之一，是植物光合作用的主要部位，良好的营养生长和叶片发育状态对繁殖成功至关重要。因此，研究基因作用于植物生长发育的分子机制对春兰的育种、生产及应用具有重要意义。而ARF基因家族在植物生长发育方面具有重要作用，可为植物的遗传改良提供重要依据。
[0003]生长素响应因子（auxin response factor, ARF）是于1997年发现的一类调控生长素响应基因表达的转录因子家族，可以通过与生长素应答元件相互作用来调控相关基因表达，从而参与多种植物的生长发育过程。在拟南芥中，AtARF1、AtARF2、AtARF7和AtARF19与叶片衰老相关，AtARF3和AtARF4则能影响叶片的极性生长于发育。在番茄中，SlARF10能够抑制叶片的生长，且叶形发生改变；SlARF12在叶的早期发育中发挥作用，而SlARF2对叶片衰老有影响。水稻OsARF19在叶节中强烈表达，参与调控水稻叶片的生长角度，Osarf111突变体也表现出剑叶夹角变小。以上研究均证明ARF转录因子在其他植物种可调控叶片的生长发育。因此，利用基因工程技术，将从春兰中克隆获得的CgARF2基因转入模式植物中，对研究其功能具有重要意义，同时极具应用前景。

技术实现思路

[0004]针对现有育种技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种春兰CgARF2基因。本专利技术的另一目的是提供春兰CgARF2基因在植物育种中的应用，尤其是在叶片生长发育方面。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种春兰CgARF2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]所述的春兰CgARF2基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]所述的春兰CARF2基因在植物叶片生长发育中的应用。
[0008]春兰CARF2基因在改变拟南芥“哥伦比亚”叶片形态的应用、在促进拟南芥“哥伦比亚”离体叶片生根中的应用、在改变拟南芥“哥伦比亚”叶片内源激素含量中的应用。
[0009]将所述春兰CgARF2基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。
[0010]有益效果：与现有技术相比，本专利技术通过对春兰CgARF2基因的克隆与鉴定，基因的
表达分析，及遗传转化，验证其功能，发现过表达CgARF2基因的拟南芥与野生型相比，莲座叶数目增多、变小、叶边缘出现卷曲，离体叶片生根率增加，且各内源激素含量发生变化，可见该基因在兰花营养生长及其他植物生产、育种中将有广泛用途。
附图说明
图1A图是春兰CgARF2基因克隆的菌检电泳图，其中，M为DL2000Marker，目的条带长度为2103bp；B图是CgARF2过表达载体双酶切验证电泳图；图2A图是CgARF2在春兰各组织中的表达情况，其中，R代表根，S代表假鳞茎，L代表叶，F代表花；B图是IAA处理下春兰CgARF2基因的表达情况；图3是春兰CgARF2基因克隆和构建的过表达载体结构示意图；图4A图是转基因拟南芥植株PCR结果图，其中，M代表DL2000Marker，1以野生型DNA为模板作为阴性对照，2
‑
8以转基因植株DNA模板；图5是过表达CgARF2基因植株与野生型拟南芥植株对比图：A图为株型比较图；B图为叶形比较图；C图为果实比较图；图6是过表达CgARF2基因植株与野生型拟南芥植株的离体叶片在含不同浓度IAA的MS培养基上的生根情况；图7是过表达CgARF2基因植株与野生型拟南芥植株叶片中的内源激素含量比较。
具体实施方式
[0011]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。
[0012]实施例1本实施例所采用的材料是春兰
‘
宋梅
’
各组织，采后速冻于液氮中，超低温冰箱（
‑
80℃）保存。
[0013]1）春兰各组织总RNA的提取按照TaKaRa植物总RNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：将超低温冻存的春兰各组织迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至分别研磨成粉末状；将研磨成粉状的样品分别加入到含有450μlBufferPE的1.5mL灭菌tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；将裂解液12,000rpm，4℃离心5分钟；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌tube中。加入上清液1/10体积的BufferNB，Vortex振荡混匀，12,000rpm，4℃离心5钟；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌tube中，加入450μL的BufferRL，使用移液枪将溶液混合均匀；加入混合液1/2体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀后，立即将混合液全部转入到RNASpinColumn中；12,000rpm，离心1分钟，弃滤液，将RNASpinColumn放回到2mlCollectionTube中；将500μL的BufferRWA加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；将600uL的BufferRWB加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；向RNASpinColumn膜中央加入50μLDNaseI反应液，室温静置15分钟；向RNASpinColumn膜中央加入350μL的BufferRWB，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；将RNASpinColumn重新安置于2mLCollectionTube上，12,000rpm离心2分钟；将RNASpinColumn安置于1.5mL的RNaseFreeCollectionTube上，在RNASpinColumn膜中央处
加入30μL的 RNase Free dH2O室温静置5分钟，12,000 rpm 离心2分钟洗脱RNA。所得RNA经浓度和纯度检测后存于
‑
80℃冰箱保存备用。
[0014]吸取2μL RNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S和18S条带较为清晰，28S条带亮度约为18S的两倍，RNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测RNA纯度，OD
260
/OD
280
和OD
260
/OD
230
均在1.8~2.1之间，完整性较好，可用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.春兰CgARF2在改变拟南芥“哥伦比亚”叶片形态的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；包括：将所述春兰CgARF2基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。2.春兰CgARF2在促进拟南芥“哥伦比亚”离体叶片生根中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；包括：将所述春兰...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐子涵，胡凤荣，朱丽华，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：