冷冻保存的内皮细胞组合物制造技术

本发明专利技术提供了在冷冻培养基中包含高密度内皮细胞(例如人脐静脉内皮细胞)的组合物、生产此类组合物的方法以及使用此类组合物制备治疗性内皮细胞组合物的方法。此类组合物和方法提供了许多优点，包括消除了在将治疗性内皮细胞组合物给予人受试者之前去除冷冻保存剂的需要，以及在用于治疗方法之前需要最少的操作和人为干预。作和人为干预。作和人为干预。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】冷冻保存的内皮细胞组合物
[0001]相关申请的引用
[0002]本申请要求2020年8月10日提交的美国临时专利申请号63/063,668的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包括已以ASCII格式电子提交的序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2021年8月10日，命名为Angiocrine_027_WO1_SL.txt且大小为1,543字节。
[0005]通过引用并入
[0006]出于仅仅那些允许通过引用并入的管辖区的目的，本公开中引用的参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，本文引用或提及的任何产品的任何制造商说明或目录均通过引用并入。通过引用并入本文本的文献或其中的任何教导可用于本专利技术的实践。美国专利号8,465,732中提供的许多一般教导可与本专利技术结合使用，或可适于与本专利技术一起使用。因此，美国专利号8,465,732的全部内容特此通过引用明确地并入本申请。

技术介绍

[0007]内皮细胞(EC)，诸如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，广泛用于研究，并且也用于细胞疗法应用的临床开发。EC(诸如HUVEC)通常以约100万个细胞/ml的浓度冷冻在含有一种或多种冷冻保存剂(诸如二甲基亚砜(DMSO))的细胞冷冻培养基中(例如，参见Polchow et al.,(2012),“Cryopreservation of human vascular umbilical cord cells under good manufacturing practice conditions for future cell banks,”Journal of Translational Medicine,10:98；Sultani et al.,(2016),“Improved Cryopreservation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells:A Systematic Approach,”Sci.Rep.,6,34393；和Pegg et al.,(2002),“Cryopreservation of vascular endothelial cells as isolated cells and as monolayers.”Cryobiology,44,46
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53)。对于临床应用，向用户提供的小瓶EC经冷冻，然后解冻、成粒以将EC与冷冻培养基和冷冻保存剂分离，重新悬浮在生理盐水中，并转移到输液袋中，然后可以将它们给予患者。可以需要合并多瓶冷冻EC的内容物和/或EC需要在培养物中扩增，以获得足够的细胞向患者给药。从接收冷冻细胞到将细胞给予患者的整个过程涉及许多操作，包括多次离心步骤、容器更换和培养基/溶液更换—每一个操作都有污染的风险。该过程也非常耗费劳力和时间，并且容易出现人为错误。因此，本领域需要提供可以允许整个过程—从接收冷冻EC到使用EC(例如通过将细胞输注到患者体内)—以最少的操作安全且有效地进行的组合物和方法。本专利技术解决了这种需要。

技术实现思路

[0008]本专利技术部分地基于这样的发现，即EC(诸如HUVEC)可以以每ml约1亿个细胞的密度冷冻和解冻，具有极好的细胞复苏(恢复，recovery)和细胞活力，然后可以在去除或不去除冷冻保存剂的情况下简单地稀释解冻的细胞，以产生可以安全地给予人类患者的治疗组合
物。据我们所知，以如此密度冷冻和解冻EC是前所未有的。
[0009]通常情况下，EC以我们在本文中描述的浓度的约1/20倍至1/100倍的浓度进行冷冻和解冻。例如，Sultani et al.的题为“Improved Cryopreservation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells:A Systematic Approach”的出版物描述了开发改善的HUVEC冷冻保存系统的工作。参见Sultani et al.,2016,Sci.Rep.,Vol.6,34393,p.1
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14。在Sultani的研究中，以100
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200万个细胞/ml的浓度冷冻HUVEC，并且虽然Sultani描述了经过调整和优化的冷冻保存方案的许多方面，但没有改变细胞冷冻密度。类似地，Polchow et al.的题为“Cryopreservation of human vascular umbilical cord cells under good manufacturing practice conditions for future cell banks”的出版物描述了用于临床使用的HUVEC的制备，并且描述了在含有10％DMSO和20％人血清白蛋白(HSA)的冷冻培养基中以100万个细胞/ml的浓度冷冻HUVEC。参见Polchow et al.,2012,Journal of Translational Medicine,Vol.10,98,p.1
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17。并且许多其它论文和细胞培养指南描述了以50万至500万个细胞/ml的浓度的冷冻保存EC和HUVEC。(例如，参见Lehle et al.,“Cryopreservation of human endothelial cells for vascular tissue engineering,”2005,Cryobiology,Vol.50,p.154
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161；Lonza,“Clonetics
TM
Endothelial Cell System；Technical Information&Instructions,”2002,www.lonza.com；Pegg.,“Cryopreservation of vascular endothelial cells as isolated cells and as monolayers,”2002,Cryobiology,Vol.44,p.46
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53；Reardon et al.,“Investigating membrane and mitochondrial cryobiological responses of HUVEC using interrupted cooling protocols,”2015,Cryobiology,Vol.71,p.306
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317；和von Bomhard et al.,“Cryopreservation of Endothelial Cells in Various Cryoprotective Agents and Media
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Vitrification versus Slow Freezing Methods,”2016,PLoS ONE,Vo.11.No.2)。
[0010]可以已经预期我们在本文中描述的极高细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，在包含有效量的冷冻保存剂的冷冻培养基中包含密度为约5000万个细胞/ml至约1.5亿个细胞/ml的E4ORF1+内皮细胞(EC)。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述EC是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述内皮细胞(EC)的密度为约7500万个细胞/ml至约1.25亿个细胞/ml。4.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述内皮细胞(EC)的密度为约1亿个细胞/ml。5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，进一步包含人血清白蛋白(HSA)。6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，进一步包含约10％的人血清白蛋白(HSA)。7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述冷冻保存剂选自由二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇和甘油组成的组。8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述冷冻保存剂是二甲基亚砜。9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，包含约5％至约10％的二甲基亚砜。10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，包含约10％的二甲基亚砜。11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述冷冻培养基包含内皮生长培养基。12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述EC包含编码腺病毒E4ORF1蛋白的重组核苷酸序列，所述腺病毒E4ORF1蛋白可操作地连接至异源启动子。13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述核苷酸序列处于载体内。14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述载体是逆转录病毒载体。15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述逆转录病毒载体是莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)载体。17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中E4ORF1是人腺病毒5型E4ORF1。18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述EC不包含整个腺病毒E4区。19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述EC不包含E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4、E4ORF5或E4ORF6编码序列或氨基酸序列。20.一种组合物，包含(a)密度为约1亿个细胞/ml的E4ORF1+EC、(b)内皮生长培养基、(c)约5％至约10％的DMSO和(d)约10％的HSA。21.一种组合物，包含(a)密度为约1亿个细胞/ml的E4ORF1+HUVEC、(b)内皮生长培养基、(c)约5％至约10％的DMSO和(d)约10％的HSA。22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，进一步包含造血干细胞或造血祖细胞。23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自骨髓。24.根据权利要求22所述的组合物，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自外周血。25.根据权利要求22所述的组合物，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自羊水。26.根据权利要求22所述的组合物，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自脐带血。27.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物处于冷冻容器中。28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述冷冻容器是冷冻管。
29.根据权利要求27所述的组合物，其中所述冷冻容器是冷冻袋。30.根据权利要求27所述的组合物，其中所述冷冻容器适于在封闭系统中将其内容物无菌转移至患者。31.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，用于在制备给予人受试者的治疗组合物中使用。32.根据前述权利要求中任一项所述的组合物在制备用于给予人受试者的治疗组合物中的用途。33.一种制备用于给予人受试者的治疗组合物的方法，所述方法包括用生理盐水溶液稀释根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中稀释后的EC细胞浓度为约300万个细胞/ml至约500万个细胞/ml，从而制备用于给予人受试者的治疗组合物。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述生理盐水包含葡聚糖40和HSA，其量使得在稀释后，所述治疗组合物包含约8％的葡聚糖和约4％的HSA。35.根据权利要求33所述的方法，其中所述方法不包括任何离心步骤。36.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述方法不包括去除冷冻培养基或冷冻保存剂。37.一种冷冻内皮细胞的方法，所述方法包括：a.以约5000万个细胞/ml至约1.5亿个细胞/ml的密...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔，
申请(专利权)人：安吉克莱茵生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：