具有动脉粥样硬化斑块靶向性的工程化外泌体、其制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种具有动脉粥样硬化斑块靶向性的工程化外泌体、其制备方法及应用，属于生物医学工程功能材料技术。工程化外泌体包括：层流剪切应力加载下血管内皮细胞释放的天然外泌体和靶向聚合物HA

【技术实现步骤摘要】
具有动脉粥样硬化斑块靶向性的工程化外泌体、其制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医学工程功能材料
，具体涉及一种具有动脉粥样硬化斑块靶向性的工程化外泌体、其制备方法及应用。

技术介绍

[0002]心血管疾病是全世界死亡率和发病率最高的疾病之一，根据世界卫生组织的报告，2019年有890万人死于心血管疾病。动脉粥样硬化是心血管疾病的主要形式之一，被认为是一种脂质在管腔堆积的慢性炎症疾病，主要的病理特征为内膜增厚、平滑肌增殖、脂质堆积、管腔狭窄和血管顺应性降低。目前，动脉粥样硬化的治疗主要包括球囊扩张支架和药物治疗两种方式。植入球囊支架常会造成血管内皮剥落等血管壁损伤，引起炎症反应造成较差的预后效果。药物治疗可以有效的治疗和缓解动脉粥样硬化的进展，但也有毒副作用较大、难达到有效的血药浓度等问题。
[0003]纳米给药可以有效地将药物递送到病灶部位，提高药物的生物利用度并减少毒副作用。外泌体作为所有类型细胞分泌的纳米级小泡，天然具有良好的生物相容性、低细胞毒性、免疫惰性和长期循环等特征，近年来外泌体作为纳米药物在动脉粥样硬化的治疗方面取得了相当大的进展，在动脉粥样硬化治疗方面展示出优越的潜力。
[0004]众所周知，正常生理层流剪切应力对于维持血管的正常生理功能至关重要，其具有动脉粥样硬化保护作用。内皮细胞作为将血管壁与血液分开的独特屏障，它们对各种血流动力学力包括层流剪切应力具有直接且高度的反应，并直接感受层流剪切力的刺激。目前已有研究显示，15dyn/cm2的正常生理层流剪切应力加载下，内皮细胞来源的外泌体存在着影响动脉粥样硬化病理进程的潜力。但是，天然的外泌体作为纳米治疗载体在体内治疗的靶向性等方面还有所受限。例如，用于动物模型治疗后多积累在肝、脾和肺部，不能够较好地作用在脉粥样硬化病理部位。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种具有动脉粥样硬化斑块靶向性的工程化外泌体、其制备方法及应用，可利用靶向聚合物HA
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Mal的作用，将外泌体靶向作用在巨噬细胞上，从而帮助外泌体靶向动脉粥样硬化斑块部位，以起到治疗动脉粥样硬化的效果。
[0006]第一方面，本专利技术提供一种具有动脉粥样硬化斑块靶向性的工程化外泌体，包括：层流剪切应力加载下血管内皮细胞释放的天然外泌体和靶向聚合物HA
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Mal；其中，靶向聚合物修饰在天然外泌体表面。
[0007]进一步地，靶向聚合物HA
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Mal的平均分子量7023.67～7170.47，天然外泌体的直径为124.2～132.1nm，工程化外泌体的直径为143.6～152.2nm。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种具有动脉粥样硬化斑块靶向性的工程化外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0009](1)在层流剪切应力加载下，使人源脐静脉内皮细胞释放天然外泌体；
[0010](2)使天然外泌体与靶向聚合物HA
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Mal进行连接反应，得到工程化外泌体。
[0011]进一步地，天然外泌体的制备方法包括：
[0012](a)对人源脐静脉内皮细胞施加大小为5～20dyn/cm2的层流剪切应力，持续6～10h后收集上清液；
[0013](b)将步骤(a)得到的上清液先后于4℃、300g条件下离心20min取上清液，于4℃、3000g条件下离心20min取上清液，于4℃、10000g条件下离心30min取上清；
[0014](c)将步骤(b)得到的上清液使用孔径为0.22μm的滤膜过滤取滤液；
[0015](d)将步骤(c)得到的滤液于超速离心机4℃、100000g的条件下离心2h，取沉淀用冰冷的无菌PBS溶液吹打重悬；所得重悬液为层流剪切应力加载下内皮细胞释放的天然外泌体。
[0016]进一步地，天然外泌体的制备方法包括：
[0017](a)对人源脐静脉内皮细胞施加大小为15dyn/cm2的层流剪切应力，持续8h后收集上清液；
[0018](b)将步骤(a)得到的上清液先后于4℃、300g条件下离心20min取上清液，于4℃、3000g条件下离心20min取上清液，于4℃、10000g条件下离心30min取上清；
[0019](c)将步骤(b)得到的上清液使用孔径为0.22μm的滤膜过滤取滤液；
[0020](d)将步骤(c)得到的滤液于超速离心机4℃、100000g的条件下离心2h，取沉淀用冰冷的无菌PBS溶液吹打重悬；所得重悬液为层流剪切应力加载下血管内皮细胞释放的天然外泌体。
[0021]进一步地，工程化外泌体的制备方法包括：
[0022]向天然外泌体中加入1mM TCEP还原剂，并在37℃下处理30min，而后加入0.5～1mM靶向聚合物HA
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Mal，于25℃下孵育反应1h，使天然外泌体与靶向聚合物HA
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Mal进行连接反应，得到工程化外泌体。
[0023]进一步地，工程化外泌体的制备方法包括：
[0024]向天然外泌体中加入1mM TCEP还原剂，并在37℃下处理30min，而后加入1mM靶向聚合物HA
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Mal，于25℃下孵育反应1h，使天然外泌体与靶向聚合物HA
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Mal进行连接反应，得到工程化外泌体。
[0025]进一步地，使用微量进样器滴加TCEP还原剂和靶向聚合物，微量进样器的滴加速度为0.5～1.5mL/h。
[0026]进一步地，微量进样器的滴加速度为1mL/h。
[0027]第三方面，本专利技术提供一种具有动脉粥样硬化斑块靶向性的工程化外泌体在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
[0028]本专利技术提供的一种具有动脉粥样硬化斑块靶向性的工程化外泌体、其制备方法及应用包括：
[0029]该工程化外泌体为表面修饰靶向聚合物HA
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Mal的层流剪切应力加载下血管内皮细胞释放的外泌体，可以使修饰的靶向聚合物与动脉粥样硬化斑块处高表达的CD44高亲和力受配体结合，使得工程化外泌体靶向巨噬细胞，作用到动脉粥样硬化斑块处，以实现对动脉粥样硬化的高效治疗。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图也属于本申请的保护范围。
[0031]图1为实施例1提供的天然外泌体与实施例2提供的工程化外泌体的形态及粒径分布。
[0032]图2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有动脉粥样硬化斑块靶向性的工程化外泌体，其特征在于，包括：层流剪切应力加载下血管内皮细胞释放的天然外泌体和靶向聚合物HA
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Mal；其中，所述靶向聚合物修饰在所述天然外泌体表面。2.根据权利要求1所述的工程化外泌体，其特征在于，所述靶向聚合物HA
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Mal的平均分子量7023.67～7170.47，所述天然外泌体的直径为124.2～132.1nm，所述工程化外泌体的直径为143.6～152.2nm。3.一种权利要求1或2所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在层流剪切应力加载下，使人源脐静脉内皮细胞释放天然外泌体；(2)使所述天然外泌体与所述靶向聚合物HA
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Mal进行连接反应，得到所述工程化外泌体。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述天然外泌体的制备方法包括：(a)对人源脐静脉内皮细胞施加大小为5～20dyn/cm2的层流剪切应力，持续6～10h后收集上清液；(b)将步骤(a)得到的上清液先后于4℃、300g条件下离心20min取上清液，于4℃、3000g条件下离心20min取上清液，于4℃、10000g条件下离心30min取上清；(c)将步骤(b)得到的上清液使用孔径为0.22μm的滤膜过滤取滤液；(d)将步骤(c)得到的滤液于超速离心机4℃、100000g的条件下离心2h，取沉淀用冰冷的无菌PBS溶液吹打重悬；所得重悬液为所述层流剪切应力加载下血管内皮细胞释放的天然外泌体。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述天然外泌体的制备方法包括：(a)对人源脐静脉内皮细胞施加大小为15dyn/cm2的层流剪切应力，持续8h后收集上清液；(b)将步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘肖珩，李春丽，房飞，王尔祥，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：