一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的引物探针组合、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术提供了一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的引物探针组合、试剂盒和检测方法，属于基因工程技术领域。所述引物探针组合包括口蹄疫病毒引物、口蹄疫病毒探针、小反刍兽疫病毒引物和小反刍兽疫病毒探针。本发明专利技术提供的试剂盒的检测具有检测速度快的优点；该检测试剂盒的检测方法具有灵敏度高的特点，对FMDV检测灵敏度约为10

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的引物探针组合、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的引物探针组合、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]口蹄疫(Foot.and.mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种感染偶蹄动物的急性、热性、高度接触传染病，临床症状主要表现为口、舌、鼻镜和蹄冠部出现水泡和溃疡，FMDV属于小RNA病毒科(Picomaviridae)口蹄疫病毒属(Aphtho.virus)，存在0、A、C、Asial、SATl、SAT2和SAT37个血清型。我国主要流行O型和A型。FMDV可以在体内长期存活，感染动物持续排毒，FMD对国内外养殖业造成了严重的经济损失，早期、快速和有效诊断是防控FMD疫情所必须的重要手段。
[0003]小反刍兽疫(pestedes petits ruminants，PPR)，是由小反刍兽疫病毒(pe stedes petits ruminants virus，PPRV)引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。1942年，PPR第一次在科特迪瓦被发现，更早也可能在其他地域存在，传播路径开始于非洲经过中东，伴随着野生动物迁移、家畜放牧、跨区域活体贸易等因素蔓延至整个亚洲等地的山羊和绵羊主要养殖地。2007年，PPRV经阿里地区传入我国，开始迅速向西北等地蔓延传播至全国各地。感染动物初期临诊症状为口鼻干燥，流黏液脓性鼻漏，呼出恶臭气体，口腔黏膜充血，颊黏膜进行性广泛性损害、导致多涎，随后出现坏死性病灶，下唇、下齿龈等口腔黏膜处开始出现小的粗糙的红色浅表坏死病灶。严重病例可见坏死病灶波及齿垫、腭、颊部及其乳头、舌头等处。后期出现带血水样腹泻，严重脱水，消瘦，随之体温下降。给我国养羊业带来巨大影响，早期、快速和有效诊断是防控PPR疫情所必须的重要手段。
[0004]口蹄疫和小反刍兽疫在我国列为一类动物疫病，均可引发小反刍动物急性、接触性、水疱性传染病，发病初期出现发热和口炎症状，临床症状症状颇为相似，不易区分，对养羊业危害巨大，在我国多个省份时有发生，早期的疫病确诊显得尤其重要。进行分子生物学实验室检测是确诊口蹄疫和小反刍兽疫的最科学且最有说服力的技术手段，诊断的速度决定这疫病传播的范围、防控成本和经济损失程度，随着各地大力发展养羊业对一类动物疫病防控越来越重视，准确而快速的诊断是控制一类动物疫病的关键。
[0005]目前对这两种疫病的实验室诊断多采用RT
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qPCR检测，口蹄疫有通用型、分型检测方法，小反刍兽疫有野毒与疫苗毒双重荧光RT
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PCR鉴别检测方法。这些检测方法虽然特异性强、灵敏度高、快速、高通量、重复性好等特点，某一动物出现发热、眼鼻分泌物增多伴有口炎症状，检测口蹄疫病毒需采集水泡皮、水泡液或者O/P液样品，检测小反刍兽疫采集眼鼻拭子样品，实验室可以同时提取这几类样品病毒核酸，但是送检实验室需要两种检测试剂盒分别检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒，现有的RT
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qPCR检测试剂盒由于检测体系和扩增条件不同，不能同时检测这两种病毒，费时耗力，成本较高，不适合大批量、长时期、高
效率监测使用。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的引物探针组合、试剂盒和检测方法，本专利技术针对口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒基因的保守区设计特异性引物和探针，建立一种能同时检测FMDV和PPRV二重荧光RT
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qPCR方法，在同一PCR检测体系中同时检测2种病毒核酸，一方面能够高效、特异检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒；另一方面能够节约检测成本，适合大批量样品监测。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的引物探针组合，包括口蹄疫病毒引物、口蹄疫病毒探针、小反刍兽疫病毒引物和小反刍兽疫病毒探针；
[0009]所述口蹄疫病毒引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0010]所述口蹄疫病毒引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0011]所述口蹄疫病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0012]所述小反刍兽疫病毒引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No4所示；
[0013]所述小反刍兽疫病毒引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[0014]所述小反刍兽疫病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0015]本专利技术还提供了一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合。
[0016]优选的，还包括阳性模板，所述阳性模板包括口蹄疫病毒O型标准株、口蹄疫病毒A型标准株和小反刍兽疫病毒野毒株。
[0017]优选的，还包括：一步法荧光反转录混合液和酶混合液。
[0018]本专利技术还提供了一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的方法，包括以下步骤：
[0019]1)提取待检样品的RNA，以所述RNA为模板利用上述技术方案所述的引物探针组合进行RT
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PCR，得到RT
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PCR结果；
[0020]2)当所述步骤1)RT
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PCR结果的Ct值小于40，扩增曲线为绿色“S”型曲线时，所述待检样品中含有口蹄疫病毒；当所述T
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PCR结果的Ct值小于40，扩增曲线为蓝色“S”型曲线时，所述待检样品中含有小反刍兽疫病毒。
[0021]优选的，所述步骤1)RT
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PCR的体系包括：
[0022]一步法荧光反转录混合液12.5μL；
[0023]酶混合液1μL；
[0024]浓度为10μmol/L的小反刍兽疫病毒引物的上游引物0.5μL；
[0025]浓度为10μmol/L的小反刍兽疫病毒引物的下游引物0.5μL；
[0026]浓度为10μmol/L的小反刍兽疫病毒探针0.2μL；
[0027]浓度为10μmol/L的口蹄疫病毒引物的上游引物0.4μL；
[0028]浓度为10μmol/L的口蹄疫病毒引物的下游引物0.4μL；
[0029]浓度为10μmol/L的口蹄疫病毒探针0.2μL；
[0030]模板5μL；
[0031]补水至25μL。
[0032]优选的，所述RT
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PCR的程序包括：55℃反转录15min；95℃预变性30s；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。
[0033]本专利技术的有益效果为：
[0034]1.与现有的方法相比该二重RT
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qPCR检测试剂盒的检测具有检测速度快的优本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的引物探针组合，其特征在于，包括口蹄疫病毒引物、口蹄疫病毒探针、小反刍兽疫病毒引物和小反刍兽疫病毒探针；所述口蹄疫病毒引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述口蹄疫病毒引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述口蹄疫病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述小反刍兽疫病毒引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No4所示；所述小反刍兽疫病毒引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述小反刍兽疫病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。2.一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性模板，所述阳性模板包括口蹄疫病毒O型标准株、口蹄疫病毒A型标准株和小反刍兽疫病毒野毒株。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：一步法荧光反转录混合液和酶混合液。5.一种同时检测口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待检样品的RNA，以所述RNA为模板利用权利要求1所述的引物探针组合进行RT
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨夷平，马春江，杨帆，杨康，方先珍，闫若潜，古丽巴哈，
申请(专利权)人：哈密市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：