生产GGPP的工程菌和生产伪蕨素前体的工程菌、方法及应用技术

本发明专利技术属于生物合成技术领域，涉及一种生产GGPP的工程菌和生产伪蕨素前体的工程菌、方法及应用，生产GGPP的工程菌为大肠杆菌，采用pCDF

【技术实现步骤摘要】
生产GGPP的工程菌和生产伪蕨素前体的工程菌、方法及应用


[0001]本专利技术属于生物合成
，尤其涉及一种生产GGPP的工程菌和生产伪蕨素前体的工程菌、方法及应用。

技术介绍

[0002]伪蕨素(Pseudopterosins)是一种分离自柳珊瑚(Pseudopterogorgia elisabethae)的二萜糖苷类化合物，具有显著的抗菌、抗炎、细胞毒性、镇痛等活性，具有很大的研究价值。由于该类化合物具有显著的皮肤抗炎作用，可减轻皮肤的泛红情况，被应用在化妆品领域，具有其它植物提取物无可比拟的舒缓修护力，能减少安抚各种刺激现象的产生，并增加皮肤的水分和养分。伪蕨素天然来源为巴哈马群岛的扇柳珊瑚，如果想获取该类化合物需要大量采集同种珊瑚，不利于海洋资源的可持续发展。有化学家尝试对该类化合物进行全合成研究，构建了其全合成路线，但是由于路线长、产率低等问题，不能完全解决伪蕨素的来源问题。
[0003]合成生物学是在解析生物合成途径基础上进行的细胞工厂搭建或者体外酶催化，绿色高效的合成目标先导化合物，避免了化学合成的危险性、有毒性及低效性，同时保护海洋资源的可持续性。组学导向的基因挖掘，配合生物合成解析，以及细胞工厂搭建，可以持续高效的生产目标化合物，为接下来的药理学等研究提供充足的原料，是可持续开发海洋资源以及提高新药开发成功率的必要之路。为了解决伪蕨素的来源问题，为其药理学研究提供充足的原料，有必要对伪蕨素的生物合成进行研究。
[0004]伪蕨素前体(Elisabethatriene)是一种二萜化合物，为通过酶催化快速大量合成伪蕨素奠定基础。伪蕨素前体可由二萜前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)环化得来。因此，如何通过工程菌株高效的生产二萜前体GGPP，再由二萜前体GGPP高效的生产伪蕨素前体，对能通过酶催化快速大量合成伪蕨素具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对上述的现有技术存在的不足，提供一种生产GGPP的工程菌和生产伪蕨素前体的工程菌、方法及应用。
[0006]本专利技术的第一个目的在于提供一种生产GGPP的工程菌，所述生产GGPP的工程菌为大肠杆菌，采用pCDF
‑
Duet质粒表达羟乙基噻唑激酶ThiM基因、IPK基因、Idi基因和Bnd3基因，所述工程菌应用于将五碳化合物底物转化为GGPP。
[0007]其中，ThiM NCBI accession NO.：WP 001195564.1；IPK NCBI accession NO.：WP 001192822.1；Idi NCBI accession NO.：WP 001192822.1；Bnd3 NCBI accession NO.：MCG8971285.1。
[0008]所述羟乙基噻唑激酶ThiM基因来自于大肠杆菌Escherichia coli，直接从基因组克隆得到；IPK基因来自于拟南芥Arabidopsis thaliana，从cDNA克隆得到；Idi基因来自于
大肠杆菌Escherichia coli，通过基因合成获得；Bnd3基因来自于链霉菌Streptomyces sp.，通过基因组克隆获得。
[0009]所述生产GGPP的工程菌的表达过程为：
[0010](1)羟乙基噻唑激酶ThiM基因过表达特异性识别具有羟基结构五碳化合物底物，将底物转化为磷酸二甲基烯丙基酯(DMAP)；
[0011](2)IPK基因过表达将DMAP转化为二甲基烯丙基焦磷酸盐(DMAPP)；
[0012](3)Idi基因过表达将DMAPP转化为焦磷酸异戊酯(IPP)；
[0013](4)Bnd3基因过表达将1分子DMAPP和3分子IPP转化为GGPP。
[0014]优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌B/r型菌株，更优选为BL21Star(DE3)大肠杆菌。
[0015]优选地，所述五碳化合物具有羟基结构。
[0016]所述的生产GGPP的工程菌根据上述方法可以重复制得，且表达稳定。
[0017]本专利技术的第二个目的在于提供一种生产伪蕨素前体的工程菌，由上述的生产GGPP的工程菌中所用的质粒与包含二萜合酶基因的质粒构建而成，所述伪蕨素前体化合物的化学结构式如下所示：
[0018][0019]优选地，所述生产伪蕨素前体的工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0020]S1.所述生产GGPP的工程菌构建时所用的同种感受态细胞于冰上解冻；
[0021]S2.在灭菌后的超纯水中加入5
×
KCM溶液、CDF
‑
MKI4质粒溶液和pET28a
‑
二萜合酶质粒溶液，得混合溶液，放在冰上降温；
[0022]S3.将上述混合溶液混合均匀，加入到解冻好的感受态细胞中，冰浴20
‑
40min，将混合溶液置于离心管中；
[0023]S4.将离心管插入浮漂中，置于40
‑
45℃的水浴锅中热激80
‑
100s，之后将离心管插入冰上，冰浴1
‑
3min；
[0024]S5.在超净台中向离心管中加入SOC溶液，将离心管置于摇菌瓶中振荡50
‑
70min后，再置于离心机中7000
‑
8000rpm离心1
‑
3min；
[0025]S6.离心完毕后，在超净台中将离心管内液体倒出，用移液枪轻轻吹打离心管底部剩余的菌液将沉淀重悬；用移液枪将重悬后的菌液吸出，加入带卡那霉素和硫酸链霉素抗性的LB平板中，进行涂布，待菌液晾干后盖上盖子，用封口膜封好，倒置于35
‑
38℃恒温培养箱中过夜培养；
[0026]S7.从所述LB平板中挑取平板上的单个菌落加入到加入卡那霉素和硫酸链霉素的LB培养基中，在摇床中培养7
‑
9h得培养菌液，所得培养菌液中的菌株即为生产伪蕨素前体
的工程菌；
[0027]S8.将所述培养菌液加入等体积灭菌的50％甘油混匀，液氮速冻后冷冻保存。
[0028]所述生产伪蕨素前体的工程菌的菌液液氮速冻后冷冻保存，在
‑
20℃冰箱保存可用一年，
‑
80℃冰箱可长期保存。
[0029]优选地，所述二萜合酶为HXL7(Uniprot Number：A0A6S7HXL7)，来自于珊瑚Paramuricea clavata，通过基因合成获得。所述HXL7二萜合酶可高效的将GGPP环化为伪蕨素前体elisabethatriene类化合物。
[0030]优选地，所述超纯水、5
×
KCM溶液、CDF
‑
MKI4和pET28a
‑
HXL7的体积比为14：4：1：1；所述超纯水与SOC溶液的体积比为1：(8
‑
10)。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产GGPP的工程菌，其特征在于，所述生产GGPP的工程菌为大肠杆菌，采用pCDF
‑
Duet质粒表达羟乙基噻唑激酶ThiM基因、IPK基因、Idi基因和Bnd3基因，所述工程菌应用于将五碳化合物底物转化为GGPP。2.根据权利要求1所述的生产GGPP的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌B/r型菌株。3.根据权利要求1所述的生产GGPP的工程菌，其特征在于，所述五碳化合物具有羟基结构。4.一种生产伪蕨素前体的工程菌，其特征在于，由权利要求1
‑
3任一项所述的生产GGPP的工程菌与二萜合酶基因构建而成，所述伪蕨素前体化合物的化学结构式如下所示：5.根据权利要求4所述的生产伪蕨素前体的工程菌，其特征在于，构建方法，包括如下步骤：S1.将所述的生产GGPP的工程菌构建时所用的同种感受态细胞于冰上解冻；S2.在灭菌后的超纯水中加入5
×
KCM溶液、CDF
‑
MKI4质粒溶液和pET28a
‑
二萜合酶质粒溶液，得混合溶液，放在冰上降温；S3.将上述混合溶液混合均匀，加入到解冻好的感受态细胞中，冰浴20
‑
40min，将混合溶液置于离心管中；S4.将离心管插入浮漂中，置于40
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45℃的水浴锅中热激80
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100s，之后将离心管插入冰上，冰浴1
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3min；S5.在超净台中向离心管中加入SOC溶液，将离心管置于摇菌瓶中振荡50
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70min后，再置于离心机中7000
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8000rpm离心1
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3min；S6.离心完毕后，在超净台中将离心管内液体倒出，用移液枪轻轻吹打离心管底部剩余的菌液将沉淀重悬；用移液枪将重悬后的菌液吸出，加...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宝福，陈宝，刘丽君，赵耀，
申请(专利权)人：烟台新药创制山东省实验室，
类型：发明
国别省市：