一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412及其提高耐盐碱的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还涉及了上述枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412在提高芽孢杆菌耐盐碱特性中的应用。本发明专利技术发现了AMEP412蛋白在提高芽孢杆菌耐盐碱特性方面的新功能，该蛋白的α螺旋六聚体结构形成亲水性离子转运通道，通过Na

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412及其提高耐盐碱的应用


[0001]本专利技术属于微生物领域，涉及一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412及其提高耐盐碱的应用。

技术介绍

[0002]我国拥有大量的盐碱地面积，如何充分开发利用盐碱地资源是当前的行业需求和研究热点。其中，通过对植物生长有促进作用微生物资源，如植物根际促生菌，提高植物在盐碱地上的适应性是一个主要趋势，可开发盐碱地有可耕作性农田进行农作物种植。然而，大部分促生菌是从非盐碱环境下分离得到，施用入盐碱地中后并不能有效定殖，造成效果大打折扣。因此，如何提高促生菌的耐盐碱特性，是急需解决的问题。
[0003]与普通菌株相比，耐盐碱菌株的一个耐盐特点在于细胞膜上具有亲水性的离子通道，能够将细胞内的盐碱离子转运到外界环境中，维持细胞内渗透压平衡。如细胞膜上的钠氢逆向转运蛋白，可以形成钠氢泵，其通过偶联H+输入将胞内Na+泵出，在细胞维持正常的内外渗透压起着关键作用。
[0004]综上所述，通过分子生物学手段在非耐盐菌株中引入外源的转运蛋白在细胞膜上形成亲水性离子通道，通过逆向钠氢转运，降低外界盐碱环境对细胞渗透压的伤害，是提高菌株耐盐碱特性的一个思路。
[0005]在之前的研究中，我们从枯草芽孢杆菌BU412中分离鉴定了AMEP412蛋白，发现从外部施用AMEP412蛋白可在植物细胞和病原菌的膜上打孔，从而激发植物免疫和杀伤病原菌。但是，AMEP412蛋白在细菌体内表达，是否能够在细菌细胞膜上形成亲水性离子通道，进而提高细菌耐盐碱特性的作用并未见报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的是提供一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412，用分子生物学手段在非耐盐菌株中引入外源的转运蛋白在细胞膜上形成亲水性离子通道，提高非耐盐菌株的耐盐碱特性。
[0007]本专利技术的第二目的是提供上述枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412的用途。
[0008]本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0009]一、一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]编码枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]二、上述的枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412在提高芽孢杆菌耐盐碱特性中的应用。
[0012]进一步的，所述的枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412通过行使Na
+
/H
+
逆向转运蛋白的功能提高芽孢杆菌的耐盐碱特性。
[0013]进一步的，所述的枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412的α螺旋二聚体结构形成亲水性离子转运通道提高芽孢杆菌的耐盐碱特性。
[0014]采用上述技术方案的积极效果：本专利技术发现了AMEP412蛋白在提高芽孢杆菌耐盐
碱特性方面的新功能，该蛋白的α螺旋六聚体结构形成亲水性离子转运通道，通过Na
+
/H
+
逆向转运提高菌体的耐盐碱特性，使芽孢杆菌能够在高盐碱浓度的固体平板上生长；本专利技术为提高芽孢杆菌的耐盐碱特性积累了新的材料。
附图说明
[0015]图1为AMEP412蛋白的Na
+
/H
+
逆向转运活性；
[0016]图2为AMEP412蛋白三维结构的俯视图；
[0017]图3为AMEP412蛋白离子通道及关键氨基酸的示意图。
具体实施方式
[0018]以下通过实施例来进一步描述本专利技术，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本专利技术的范围。
[0019]本专利技术中生物材料的来源：
[0020]1、所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BU412于2016年3月30日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCM 2016142；
[0021]2、所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800N购自普健生物(武汉)科技有限公司；
[0022]3、pHT43表达载体购自普健生物(武汉)科技有限公司。
[0023]实施例1
[0024]本实施例说明AMEP412蛋白表达载体和表达菌株构建。
[0025]编码枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。根据编码基因设计AMEP412蛋白的表达载体，前后酶切位点分别为NdeI(CATATG)/EcoRI(CTCGAG)，在基因前端引入6
×
His标签(catcatcatcatcatcac)和凝血酶切割位点(ctggtgccgcgcggcagc)，由普健生物(武汉)科技有限公司进行全基因合成并亚克隆至pHT43表达载体上。
[0026]将插入AMEP412编码基因的pHT43表达载体质粒DNA，转化芽孢杆菌感受态细胞WB800N，经过蓝白斑筛选和PCR验证阳性克隆。将得到的阳性克隆进行IPTG诱导表达，得到如下的AMEP412蛋白表达产物。其中，1
‑
13位为MGSSHHHHHHSSG，是具有GS接头的6
×
His标签，14
‑
19位为LVPRGS，为凝血酶切割位点，之后为AMEP412的氨基酸序列。枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0027]实施例2
[0028]本实施例说明AMEP412蛋白提高芽孢杆菌的耐盐碱特性。
[0029]挑取阳性菌B.subtilis WB800N/pHT43
‑
AMEP412进行耐盐碱性测试，以B.subtilis WB800N为对照。培养基基础配方为葡萄糖10g/L，酵母粉20g/L，NaCl 10g/L，pH 7.5。在耐盐性测试中，NaCl设置为10、15、20、25g/L的浓度梯度，其余配方保持不变。在耐碱性测试中，pH设置为7.5、8、8.5、9的梯度，其余配方保持不变。
[0030]以1％接种的接种量将待测菌株接种入100mL液体培养基中，在37℃、160rpm条件下培养24小时，加入2mM的IPTG诱导4小时。取3mL菌液测定OD600的光吸收值，进行统计分
析。
[0031]耐盐性检测结果见表1。结果显示，与对照菌株WB800N相比，菌株WB800N/pHT43
‑
AMEP412在20g/L和25g/L盐浓度下仍能保持生长，而对照的OD值则在20g/L盐浓度下快速下降，在25g/L盐浓度下几乎不能生长，差异均达到显著水平，这说明AMEP412蛋白在芽孢杆菌内的表达显著增强了菌株的耐盐性。
[0032]表1不同盐浓度梯度下芽孢杆菌生长的OD值
[0033][0034]耐碱性检测结果见表2。结果显示，与对照菌株WB800N相比，菌株WB800N/pHT43
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AMEP412在8.5和9的pH下仍能保本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.编码枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412在提高芽孢杆菌耐盐碱特性中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的枯草...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘权，王艳红，
申请(专利权)人：黑龙江权晟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：