异天冬氨酸的检测方法技术

本文披露了处理蛋白质和检测蛋白质中的异天冬氨酸(isoAsp)的方法。还披露了被配置用于处理蛋白质和检测蛋白质中的isoAsp的质谱系统。系统。系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】异天冬氨酸的检测方法
[0001]相关申请的交叉引用以及通过引用并入以电子方式提交的材料
[0002]本申请要求2020年10月1日提交的美国临时专利申请号63/086,557和2021年7月2日提交的美国临时专利申请号63/218,186的优先权，将其通过引用以其全文特此并入
[0003]本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表作为名为“55797_Seqlisting.txt”的文件提供，该文件创建于2021年9月20日，并且大小为7,091字节。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文并入本文。

技术介绍

[0004]蛋白质翻译后修饰(PTM)如精氨酸甲基化1、磷酸化2、泛素化3、糖基化4‑5和O
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连接的β
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N
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乙酰氨基葡萄糖修饰6‑7在细胞生物学中发挥的功能现在已经得以很好地确立。蛋白质也可以发生自发的化学降解，在老化后或在应激条件下可容易检测到9。当前文献包含许多关于在细胞蛋白质和生物治疗剂二者中鉴定的此类化学修饰的表征的研究
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12
。此类化学修饰的实例包括甲硫氨酸和色氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺以及天冬氨酸异构化
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。大多数稳定的修饰表现出非常特定的质量变化，如色氨酸(Trp)和甲硫氨酸(Met)氧化为+15.994Da，以及天冬酰胺(Asn)脱酰胺为+0.984Da
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。但是，在天冬氨酸异构化的情况下，修饰后质量没有变化。
[0005]在用于人类应用的生物治疗剂的开发期间，尽早鉴定对候选分子的活性和稳定性产生负面影响的化学负担是有利的。通常会对蛋白质进行一系列强制降解研究，以确定它们的稳定性、适当的保质期、适当的储存和运输条件，这一过程称为“分子评估”30
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。受化学修饰影响的分子可能会被取消选择或进行另一轮蛋白质工程以减轻不利影响
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。大多数化学修饰可以通过液相色谱
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串联质谱(LC
‑
MS/MS)和数据处理进行鉴定
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。天冬氨酸异构化的鉴定提出了更具挑战性的问题。由于修饰后产生的结构影响，几种治疗性mAb中的isoAsp形成已显示会导致活性丧失
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。因此，必须仔细监测和控制其在生物治疗剂制造期间的发生
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。
[0006]因此，本领域需要检测异天冬氨酸(isoAsp)的有效方法。

技术实现思路

[0007]在一方面，本文披露了处理蛋白质的方法。在各种实施例中，该方法包括：(a)将蛋白质消化成肽，(b)对这些肽进行质谱并通过质谱(例如串联质谱(MS/MS))测量异天冬氨酸(isoAsp)N端肽键的碎裂；(c)将该碎裂与阈值进行比较，其中该碎裂超过该阈值指示在所分析的肽中或最终在该蛋白质中存在该isoAsp。在一些实施例中，这些方法还包括(d)拒绝包含该isoAsp的蛋白质，或工程化该蛋白质以去除该isoAsp。
[0008]在各种实施例中，本文所述的方法还包括在(b)之前减少进行质谱的肽的电荷(z)。在一些实施例中，在(b)中进行质谱的这些肽带单电荷。在任何描述的方法中，该碎裂被测量为b系列峰、y系列峰或两者。
[0009]所披露的方法可以用任何类型的质谱方法进行。例如，用于本文所述方法的质谱
包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间/飞行时间(MALDI
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TOF/TOF)或液相色谱
‑
质谱/质谱(LC
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MS/MS)。在相关实施例中，LC
‑
MS/MS包括电喷雾电离。
[0010]在任何披露的方法中，将蛋白质消化成肽可以在蛋白质的热应激之后、然后用蛋白水解酶进行酶消化进行。例如，该蛋白水解酶包括胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或弹性蛋白酶中的至少一种。
[0011]在各种实施例中，在该蛋白质的氨基酸序列中该isoAsp不与天冬酰胺相邻和/或在该蛋白质的氨基酸序列中该isoAsp不与苏氨酸相邻。
[0012]在各种实施例中，在该蛋白质的氨基酸序列中该isoAsp与相邻的天冬氨酸残基相邻。在相关实施例中，该相邻的天冬氨酸是isoAsp或L
‑
Asp。
[0013]在披露的方法中，肽碎裂的阈值水平用作确定isoAsp是否存在于蛋白质中的标准。例如，阈值可以是对照肽如合成肽的肽键的碎裂水平。在各种实施例中，当isoAspN端的碎裂肽键的b峰和/或y峰存在时，该肽的碎裂超过该阈值。
[0014]在各种实施例中，本文所述的方法还包括对对照肽进行质谱，从而获得该对照肽的肽键的碎裂。在各种实施例中，该对照肽不经受热应激。在相关实施例中，该对照肽是合成肽。在各种实施例中，该合成肽可用于与一种或多种蛋白质样品进行比较。在各种实施例中，该阈值为对照肽中L
‑
Asp N端肽键的碎裂水平。在各种实施例中，该对照肽的肽键的碎裂作为电子存储值提供，或者由经受与被测蛋白质样品相同的质谱方法的参考肽提供。
[0015]在任何披露的方法中，蛋白质包括以下或由以下组成：抗体、抗体蛋白产物、双特异性T细胞衔接器分子、抗体片段、抗体融合肽或其抗原结合片段、肽、生长因子或细胞因子。在相关实施例中，该抗体是多克隆或单克隆抗体。如本文所用，术语“抗体蛋白产物”是指在各种情况下基于抗体的架构但在自然界中未发现的若干抗体替代物中的任一种。在一些方面，该抗体蛋白产物的分子量在至少约12kDa
‑
1MDa，例如至少约12kDa
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750KDa、至少约12kDa
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250kDa或至少约12kDa
‑
150kDa的范围内。在某些方面，该抗体蛋白产物具有从单体(n＝1)到二聚体(n＝2)、到三聚体(n＝3)、到四聚体(n＝4)的价数(n)范围，如果不是更高阶的价数的话。在一些方面，抗体蛋白产物是基于完整抗体结构的那些和/或模拟保留完整抗原结合能力的抗体片段的那些，例如scFv、Fab和VHH/VH(下文讨论)。保留其完整抗原结合位点的最小抗原结合抗体片段为Fv片段，其完全由可变(V)区组成。使用可溶性柔性氨基酸肽接头将V区连接至scFv片段(可变单链片段)以使该分子稳定，或将恒定(C)结构域添加至V区以产生Fab片段[抗原结合片段]。scFv和Fab片段可以容易地在宿主细胞例如原核宿主细胞中产生。其他抗体蛋白产物包括经二硫键稳定的scFv(ds
‑
scFv)、单链Fab(scFab)以及二聚及多聚抗体形式，如双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体，或包含由与寡聚结构域连接的scFv组成的不同形式的迷你抗体(miniAb)。最小的片段是骆驼科重链Ab的VHH/VH以及单结构域Ab(sdAb)。最常用于建造新颖抗体形式的构件为单链可变(V)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种处理蛋白质的方法，该方法包括：(a)将蛋白质消化为肽，(b)对这些肽进行质谱，并通过质谱测量isoAsp N端肽键的碎裂；(c)将该碎裂与阈值进行比较，其中该碎裂超过该阈值指示该蛋白质中存在该isoAsp；和(d)拒绝包含该isoAsp的蛋白质，或工程化该蛋白质以去除该isoAsp。2.如权利要求1所述的方法，该方法还包括在(b)之前减少电荷。3.如权利要求1或2所述的方法，其中在(b)中进行质谱的这些肽带单电荷。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中该碎裂被测量为b系列峰、y系列峰或两者。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该质谱是基质辅助激光解吸/电离飞行时间/飞行时间(MALDI
‑
TOF/TOF)。6.如权利要求2
‑
5中任一项所述的方法，其中该质谱是液相色谱
‑
质谱/质谱(LC
‑
MS/MS)。7.如权利要求6所述的方法，其中该LC
‑
MS/MS包括电喷雾电离。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中(a)包括热降解。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中(a)包括用蛋白水解酶进行酶消化。10.如权利要求9所述的方法，其中该蛋白水解酶包括胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或弹性蛋白酶中的至少一种。11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在该蛋白质的氨基酸序列中该isoAsp不与天冬酰胺相邻和/或在该蛋白质的氨基酸序列中该isoAsp不与苏氨酸相邻。12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在该蛋白质的氨基酸序列中该isoAsp与相邻的天冬氨酸残基相邻。13.如权利要求12所述的方法，其中该相邻的天冬氨酸是isoAsp或L
‑
Asp。14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中当isoAsp N端的碎裂肽键的b峰和/或y峰存在时，该碎裂超过该阈值。15.如权利要求1
‑
13中任一项所述的方法，其中该阈值为对照肽中L
‑
Asp N端肽键的碎裂。16.如权利要求15所述的方法，其中该对照肽的肽键的碎裂作为电子存储值提供。17.如权利要求15所述的方法，该方法还包括对该对照肽进行质谱，从而获得该对照肽的肽键的碎裂。18.如权利要求15
‑
17中任一项所述的方法，其中该对照肽是合成肽。19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该蛋白质是大肽、抗体、抗体片段、抗体融合肽或其抗原结合片段。20.如权利要求19所述的方法，其中该抗体是多克隆或单克隆抗体。21.如前述权利要求中任一项所述的方法，该方法还包括确定该isoAsp在该...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：安进公司，
类型：发明
国别省市：