一种乙酸渗透酶A基因RkAcpa及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种乙酸渗透酶A基因RkAcpa，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；该基因分离自红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235，将该基因与载体连接，转入红冬孢酵母细胞中，实验结果显示过表达RkAcpa基因会使得该菌株类胡萝卜素合成水平的提高；本发明专利技术通过基因工程手段对微生物进行改造，来提高微生物体内类胡萝卜素的产量，为大规模商业化生产类胡萝卜素奠定基础。为大规模商业化生产类胡萝卜素奠定基础。为大规模商业化生产类胡萝卜素奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种乙酸渗透酶A基因RkAcpa及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一种乙酸渗透酶A基因RkAcpa及其在提高红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)类胡萝卜素产量中的应用。

技术介绍

[0002]乙酸渗透酶A基因在丝状真菌球曲霉
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构巢曲霉(Aspergillus nidulans)利用乙酸盐途径中被发现，该基因位于V染色体上，但它与其他五个参与乙酸酯代谢的基因座(fac(AN5626)、acuD(AN5634)、acuG(AN5604)、acuH(AN5336)、acuN(AN5746)并没有密切的联系。Jen1和Ady2是两个负责离子形式的乙酸转运子，Ady2是酿酒酵母中发现的乙酸摄入转运(AceTr)家族的成员之一，该家族蛋白拥有相似的大小以及5～6个预测的跨膜结构，是一类在古细菌、真细菌和一些简单或复杂真核生物中发现的具有保守功能域的一类转运蛋白。Acpa基因与Ady2基因具有高度同源性，因此，Acpa、Jen1、Ady2是同一个家族蛋白。
[0003]研究发现，Acpa突变菌株较于野生菌株不可以利用乙酸盐，这与哺乳动物MTC(单羧酸盐转运蛋白)相似。在酿酒酵母中，五种蛋白质显示出与人类MCT转运蛋白的实质相似，但是没有一种蛋白质对羧酸的跨质膜运输起到作用，大多数主要与细胞内结构有关。因此，Acpa是第一个实验支持的丝状真菌MCT的候选蛋白。在酿酒酵母中，已经描述了两种功能性MCTs：一种是由乳酸、乙酸酯、丙酸和丙酮酸共享的高亲和力转运蛋白，另一种是亲和力较低且底物特异性更有限的转运蛋白，因为它只运输乙酸酯、丙酸和甲酸；前者被发现为Jen1(TC
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2.A.1.12.2)，是一种膜蛋白，属于主要辅助超家族(TC
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2.A.1)，后者取决于酵母Acpa同源物Ady2的完整性。
[0004]类胡萝卜素是一类橙黄色、橙红色或红色的多烯类化合物，具有重要的营养价值，β
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胡萝卜素、α
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胡萝卜素和β
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隐黄素是动物体内合成维生素A的前体物质，缺乏维生素A可导致夜盲症、干眼症、角膜溃疡等。
[0005]天然色素主要来源于植物和微生物，其中，植物源色素主要采用植物原料直接提取法制备，但植物的生长周期较长使得植物在大规模应用中受限；相对于植物源色素，采用微生物源色素发酵合成法制备，具有工艺绿色、稳定、发酵原料易得、发酵周期短等优势。因此，采用基因工程技术改造发酵菌株制备微生物源类胡萝卜素成为了发酵类胡萝卜的新方法。
[0006]目前，关于乙酸渗透酶A基因Acpa在促进微生物生产类胡萝卜素中鲜有报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种乙酸渗透酶基因RkAcpa，该基因是从红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235中分离得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因序列长为831bp，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽，将该基因与载体连接，转入红冬孢酵母细胞中，这个基因表达水平的提高促进了红冬孢酵母中类胡萝卜素的合成。
[0008]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0009]1、从红冬孢酵母YM25235中提取总RNA，然后反转录成cDNA，以合成cDNA为模板，采用扩增RkAcpa的特异引物，通过聚合酶链式反应扩增获得目的序列，将载体pRH2034进行双酶切、回收，用一步克隆法将目的片段和载体连接，获得连接产物重组质粒pRHRkAcpa，将重组质粒pRHRkAcpa转入大肠杆菌中，通过PCR筛选出阳性单克隆，重组质粒pRHRkAcpa用BamHⅠ、EcoR
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两个限制性内切酶进行酶切验证，验证阳性的克隆子培养后提取质粒，测序，获得片段大小为831bp的乙酸渗透酶基因RkAcpa；
[0010]2、利用PEG介导的原生质体法将重组载体pRHRkAcpa转化至红冬孢酵母YM25235中，筛选转化子，获得含有pRHRkAcpa的过表达菌株，含有pRHRkAcpa的过表达菌株经YPA培养基(酵母浸粉1％、蛋白胨2％、乙酸钠2％)培养，提取色素，利用紫外
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可见分光光度计测量总类胡萝卜素的含量。
[0011]本专利技术提供了一种生产类胡萝卜的新方法，本专利技术通过基因工程手段对微生物进行改造，来提高微生物体内类胡萝卜素的产量，从红冬孢酵母YM25235的提取的总RNA反转录的cDNA中分离得到乙酸渗透酶基因RkAcpa，红冬孢酵母YM25235中RkAcpa基因的过表达引起细胞内这个基因的转录水平的提高，继而翻译成相应蛋白，引起细胞内与类胡萝卜素合成相关的酶的表达量的提高；红冬孢酵母YM25235具有生产周期短、遗传稳定、生产安全等优点，本研究结果有助于阐明红冬孢酵母YM25235中产类胡萝卜素机制，为揭示微生物提高类胡萝卜素产量机制提供参考，对类胡萝卜素的工业化生产提供良好的应用前景和经济效益，为大规模商业化生产类胡萝卜素奠定基础；本专利技术方法简单，易操作，适于工业化生产和市场推广应用。
附图说明
[0012]图1为本专利技术的红冬孢酵母YM25235的RkAcpa基因的PCR扩增图；1.DNA分子量标记DL2000；2.阴性对照；3.基因RkAcpa的cDNA片段；
[0013]图2为重组质粒pRHRkAcpa的质粒图谱；
[0014]图3为菌落PCR验证电泳图；1.DNA分子量标记DL2000；2.基因RkAcpa的cDNA片段；3
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7为转化子；
[0015]图4为重组质粒pRHRkAcpa限制性酶切分析；其中：1.DNA分子量标记DL10000；2.阴性对照3.质粒pRH2034的BamHⅠ和EcoR V双酶切；4.重组质粒pRHRkAcpa的BamHⅠ、EcoR V双酶切；5.基因RkAcpa的cDNA片段；6.DNA分子量标记DL2000；
[0016]图5为重组质粒pRHRkAcpa转化红冬孢酵母YM25235阳性克隆验证；1.DNA分子标量DL2000；2.阴性对照；3.以YM25235基因组扩增的PCR产物；4.以质粒pRHRkAcpa扩增的PCR产物；5.以YM25235/pRHRkAcpa菌株基因组扩增的PCR产物；
[0017]图6为过表达菌株YM25235/pRHRkAcpa与对照菌株YM25235的类胡萝卜素含量比较结果。
具体实施方式
[0018]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂，使用常规方法；
[0019]实施例1：从红冬孢酵母YM25235中分离乙酸渗透酶基因RkAcpa及过表达载体pRHRkAcpa的构建
[0020]采用生工生物工程(上海)股份有限公司的UNlQ
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙酸渗透酶A基因RkAcpa，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1所述的乙酸渗透酶A基因RkA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琦，范晶蝶，熊超，魏云林，陈媛，邱婧雯，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：