一种检测基因甲基化水平的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术属于医学检验技术领域，具体涉及一种检测基因甲基化水平的引物探针组合及其应用。本发明专利技术提供了一种引物探针组合，所述引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种检测基因甲基化水平的引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于医学检验
，具体涉及一种检测基因甲基化水平的引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)简称肝癌，是常见的致命恶性肿瘤，是全球发病率最高的十大癌症之一，死亡率在消化系统恶性肿瘤中为第2位，仅次于胃癌。肝癌起病隐匿，早期无特异性症状，大多数肝癌患者在就诊时已是中晚期，手术治愈率低，生存期短，病死率逐年增高，给人类健康和社会经济带来沉重的负担。
[0003]临床上诊断肝癌的方法主要包括血清学指标、CT、MRI、超声造影术、血管造影、PET
‑
CT、肝脏细针穿刺活检。甲胎蛋白(α
‑
fetoprotein，AFP)是胚胎干细胞产生的一种特殊蛋白质，是肝癌发生、发展过程中表达的蛋白质，其特异性高，临床上可作为肝癌筛查的血清学指标，广泛应用于肝癌的筛查和早期诊断。目前甲胎蛋白诊断肝癌的敏感度和特异度均难以满足临床需求，约30％肝癌患者血清AFP值可处于正常范围值内。
[0004]中国专利CN115184515A公开了一种用于肝癌诊断的联合型血浆代谢标记物，包括L
‑
棕榈酰肉碱和1
‑
棕榈酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱，还包括癸酸。该专利技术的联合型血浆代谢标记物L
‑
棕榈酰肉碱、1
‑
棕榈酰
‑/>sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱在肝癌组明显降低，癸酸也明显降低，且与患者的肝功能损害程度指标ALT以及临床常规肝癌诊断标记物AFP进行相关性分析，显示均不相关，说明其诊断肝癌的独特性。检测方法易操作、所需上样量较少、灵敏度高。
[0005]但标志物的特异性和灵敏性均未达到可作为质控品的标准。目前市面上销售的人DNA甲基化标准品大多是人DNA甲基化通用标准品，是经甲基转移酶处理获得，理论上在所有包含CG二核苷酸的胞嘧啶位置均可被甲基化。但是在实际检测中发现，并非在所有CG位点均100％甲基化，且不同批次间存在较大差异。因此，难以满足特定靶序列不同甲基化水平参考品的需求，且目前并无DNA甲基化的国家一级和二级标准物质。
[0006]经研究发现，在肝癌患者癌组织及癌旁组织DNA中，MTHFD2、FAR1和OTX1基因的CpG岛存在显著的甲基化差异，以这三个基因的甲基化作为检测标志物进行联合检测对肝细胞癌的筛查或辅助诊断具有重大意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术的术语和声明：
[0008]本专利技术中，术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA中碱基的排列顺序。
[0009]本专利技术中，术语“引物”是指人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。
[0010]本专利技术中，术语“探针”是指是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。
[0011]本专利技术中，术语“质控品”是指用于检查分析仪器或方法的性能，是一种稳定的物
质。
[0012]本专利技术中，术语“GM12878细胞”是一种人B淋巴细胞。
[0013]本专利技术中，术语“纯化”是指采取物理、化学、或生物等方面的措施，将某种介质中的其他成分去除掉从而得到更高纯度的该介质的过程。在本专利技术的一些实施例中，所述DNA的纯化方法包括但不限于氯仿/异戊醇纯化
‑
乙醇沉淀法、硅胶柱纯化法。
[0014]本专利技术中，术语“甲基化”是指从活性甲基化合物上将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。
[0015]本专利技术中，术语“参考品”是指用于微生物(或其产物)的定性鉴定或疾病诊断的生物试剂、生物材料或特异性抗血清；或指用于定量检测某些制品的生物效价的参考物质。
[0016]本专利技术中，术语“数字PCR”是一种核酸分子绝对定量技术。数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。
[0017]本专利技术中，术语“人DNA甲基化通用标准品”是由HCT116 DKO细胞DNA经M.SssI甲基转移酶处理获得。
[0018]本专利技术技术方案包括：
[0019]一方面，本专利技术提供了一种引物探针组合，所述的引物包括ME
‑
FA
‑
F2、ME
‑
FA
‑
R2、ME
‑
MD
‑
F1、ME
‑
MD
‑
R1、ME
‑
OX
‑
F2
‑
1和ME
‑
OX
‑
R2
‑
1；所述的探针包括ME
‑
FA
‑
RP2
‑
2、ME
‑
MD
‑
HP1和ME
‑
OX
‑
FP2；
[0020]所述的ME
‑
FA
‑
F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0021]所述的ME
‑
FA
‑
R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0022]所述的ME
‑
MD
‑
F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0023]所述的ME
‑
MD
‑
R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0024]所述的ME
‑
OX
‑
F2
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0025]所述的ME
‑
OX
‑
R2
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0026]所述的ME
‑
FA
‑
RP2
‑
2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
[0027]所述的ME
‑
MD
‑
HP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
[0028]所述的ME
‑
OX
‑
FP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0029]优选地，所述的探针5
’
端标记有荧光报告基因，3
’
端标记有荧光淬灭基因。
[0030]进一步优选地，所述的荧光报告基团选自FAM、ROX、HEX、CY5、VIC、TET、JOE、Cy3、Cy7、RED61本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物探针组合，其特征在于，所述的引物包括ME
‑
FA
‑
F2、ME
‑
FA
‑
R2、ME
‑
MD
‑
F1、ME
‑
MD
‑
R1、ME
‑
OX
‑
F2
‑
1和ME
‑
OX
‑
R2
‑
1；所述的探针包括ME
‑
FA
‑
RP2
‑
2、ME
‑
MD
‑
HP1和ME
‑
OX
‑
FP2；所述的ME
‑
FA
‑
F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的ME
‑
FA
‑
R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的ME
‑
MD
‑
F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述的ME
‑
MD
‑
R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述的ME
‑
OX
‑
F2
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述的ME
‑
OX
‑
R2
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述的ME
‑
FA
‑
RP2
‑
2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述的ME
‑
MD
‑
HP1的核苷酸序列如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈子和，覃琼瑶，邓勇，何翔，戴立忠，
申请(专利权)人：长沙索科亚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：