一种SSR分子标记组合及其在检测薄壳山核桃品种中的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种SSR分子标记组合及其在检测薄壳山核桃品种中的应用。所述SSR分子标记组合包括：SSR12

【技术实现步骤摘要】
一种SSR分子标记组合及其在检测薄壳山核桃品种中的应用


[0001]本专利技术涉及分子标记
，尤其涉及一种SSR分子标记组合及其在检测薄壳山核桃品种中的应用。

技术介绍

[0002]薄壳山核桃(学名：Carya illinoinensis(Wangenh.)K.Koch)又名美国山核桃，属胡桃科山核桃属的一种植物，为多年生高大落叶乔木。作为世界著名的高档干果、油料树种和材果兼用优良树种，具有较高的应用价值。薄壳山核桃良种的选育多依赖于种子繁殖，而由于林木世代周期长，后代变异系数大的特点，因此多以引进的品种为主。而由于引种历史较长，并且早期的引种多为种条，单从形态上难以区分，难免造成品种间相互混杂，造成同名异物或者同物异名的现象。这对于薄壳山核桃种质评价，遗传改良及面上推广工作带来极大的不便。
[0003]薄壳山核桃品种卡多(Caddo)为雄先型品种。卡多坚果平均重5.4g，具有长势好，结实率高，丰产稳产，抗病力强和适应性强等特点。薄壳山核桃苗期较长，需要4
‑
6年，且雌雄异花，雌雄花期不遇，往往需要不同品种之间合理搭配来实现充分授粉和稳产，因此早期建园的品种鉴定尤为重要。在生产实践中，同一品种在不同发育时期，不同地域条件，栽培条件下的表型性状差异较大，因此依赖经验性的品种鉴定往往会造成偏差。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种SSR分子标记组合及其在检测薄壳山核桃品种中的应用。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种SSR分子标记组合，包括：SSR12
‑
1和SSR6
‑
2；所述SSR12
‑
1位于Chr12:22685469bp
‑
22685482bp，重复序列为CT，重复7次；所述SSR6
‑
2位于Chr06:7785735bp
‑
7785761bp，重复序列为CTT，重复9次。
[0006]进一步地，所述SSR分子标记组合的基因组版本为Cillinoinensis_573_v1.1。
[0007]第二方面，本专利技术提供一种用于检测所述SSR分子标记组合的引物对，包括：Chr12
‑
SSR1，Chr6
‑
SSR2；
[0008]所述Chr12
‑
SSR1包括：
[0009]上游引物：5
′‑
CCCCACTCCCCCAGATTTTC
‑3′
，
[0010]下游引物：5
′‑
AGGAGCTCAACATGAGTGCC
‑3′
；
[0011]所述Chr6
‑
SSR2包括：
[0012]上游引物：5
′‑
CAACAAGCAACACCCTCAGC
‑3′
，
[0013]下游引物：5
′‑
AAGGAAAGCGGCATCGAGAA
‑3′
。
[0014]本专利技术进一步提供包括所述引物对的试剂盒。
[0015]第三方面，本专利技术提供一种检测薄壳山核桃品种的方法，包括：
[0016]提取待测薄壳山核桃的基因组DNA；采用所述引物对对所述基因组DNA进行PCR扩
Grande,Rosey,Candy,Mouidan。
[0033]实施例1SSR分子标记的开发
[0034]1、本实施例从薄壳山核桃全基因组序列中发掘超过41万个SSR位点，批量设计特异性引物超过34万对。进一步对这些引物进行筛选，主要筛选标准如下：(1)SSR位点的类型为2～6个碱基重复；(2)上下游引物的退火温度相差不超过1℃；(3)目标产物在150bp～350bp。初步筛选并合成32对引物。
[0035]2、用CTAB法提取植物基因组DNA
[0036](1)将0.5克薄壳山核桃幼嫩叶片用液氮充分研磨后，装入2ml离心管中。
[0037](2)往离心管中加入600μl预热的CTAB提取缓冲液，65℃水浴30min，期间每隔10min颠倒混匀若干次。
[0038](3)加入600μl苯酚：氯仿：异丙醇(25:24:1),上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，将上层水相转移至新的离心管中。
[0039](4)加入等体积氯仿：异丙醇(24:1)，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，将上清转移至新的1.5mL离心管。
[0040](5)加入0.4倍体积的异丙醇，
‑
20℃放置30min以上。
[0041](6)12000rpm离心30min，弃去上清，加入75％乙醇洗涤两次；
[0042](7)将离心管开盖晾干后，加入100μl ddH20溶解DNA，使用Nanodrop2000检测DNA浓度和纯度，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
[0043]3、PCR检测
[0044]初筛所用的SSR普通引物由浙江尚亚生物技术有限公司合成，带接头普通引物及通用荧光引物由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0045]PCR扩增体系和反应条件如下：
[0046]表1 PCR扩增体系
[0047][0048][0049]表2 PCR反应条件：
[0050][0051]将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，进行引物的初步筛选。具体入下：
[0052]配制1％的琼脂糖凝胶，吸取3μL上述PCR扩增产物混合0.5μL溴酚蓝上样，120V电压下30分钟。在紫外灯下观察电泳结果并拍照。
[0053]4、毛细管电泳检测条带大小
[0054](1)将ABI HiDi Formamide与ABI GeneScan 500LIZ Size Standard的内标按99：1混合，配成混合液。
[0055](2)将mix分装到96孔反应板中，每孔10μl。将96孔板置于平板离心机中，1200rmp离心15s。
[0056](3)在96孔板中对应加入1μl PCR样品，置于平板离心机，1200rmp离心15s。
[0057](4)使用封板膜密封96孔板，将其置于PCR仪。变性程序为98℃，5min，不加热热盖，程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却。
[0058](5)将96孔板置于平板离心机中，1200rmp离心15s。
[0059](6)上样至3730测序仪进行毛细管电泳。
[0060](7)使用Genemapper软件分析SSR数据。
[0061]最终得到两对引物扩增效果好，稳定性强，其序列如下：
[0062]所述Chr12
‑
SSR1包括：
[0063]上游引物：5
′‑
CCCCACTCCCCCAGATTTTC
‑3′
，...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SSR分子标记组合，其特征在于，包括：SSR12
‑
1和SSR6
‑
2；所述SSR12
‑
1位于Chr12:22685469bp
‑
22685482bp，重复序列为CT，重复7次；所述SSR6
‑
2位于Chr06:7785735bp
‑
7785761bp，重复序列为CTT，重复9次。2.一种用于检测权利要求1所述SSR分子标记组合的引物对，其特征在于，包括：Chr12
‑
SSR1，Chr6
‑
SSR2；所述Chr12
‑
SSR1包括：上游引物：5
′‑
CCCCACTCCCCCAGATTTTC
‑3′
，下游引物：5
′‑
AGGAGCTCAACATGAGTGCC
‑3′
；所述Chr6
‑
SSR2包括：上游引物：5
′‑
CAACAAGCAACACCCTCAGC
‑3′
，下游引物：5
′‑
AAGGAAAGCGGCATCGAGAA
‑3′<...

【专利技术属性】
技术研发人员：常君，张成才，姚小华，王开良，陆铸畴，解懿妮，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：