一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法技术

本发明专利技术公开了一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取安来霉素的方法。属于由发酵后菌丝体提取安来霉素的技术。该方法通过发酵法获得安来霉素，以发酵后的菌丝体为原料，经过细胞破碎、安来霉素粗提物的制备、大孔树脂的吸附、梯度洗脱和浓缩干燥的过程得到安来霉素。其特征在于安来霉素粗提物的制备是将菌丝体破碎后恒温震荡提取，提取液在真空下减压浓缩得粗提物，粗提物用大孔树脂进行吸附；静止吸附后梯度洗脱，再经过减压浓缩得到产品。本发明专利技术工艺简单，生产周期短，生产成本低，适合于工业化生产，具有一定的社会、经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分离工程
，涉及一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提 取的方法。
技术介绍
自1945年青霉素的发现到现在各种抗生素的广泛使用，抗生素不仅在人类 疾病的治疗和预防中发挥着巨大的作用，在农业尤其是畜牧业中也有举足轻重的 地位。我国是一个农业大国，畜牧业作为农业的重要支柱产业发展迅速，近几年(2006年)畜牧业产值占农业比重达到35%。畜牧业对抗生素的依赖性很大， 目前国内每年抗生素花费约5亿美元，并且随着新的抗生素品种不断被研制开 发，抗生素在配合饲料中的用量逐渐扩大，目前我国平均每年已有约6000t的抗 生素用作饲料添加剂。然而，随着抗生素的广泛使用，逐渐出现药物残留与耐药性问题，当人类食 用含有抗生素残留物的肉制品、奶制品时，带来的隐患和弊端极其严重，要消除 已有的耐青霉素、沙星类的病菌，需要人类长达100年左右彻底不再使用这两种 药物，耐药性菌株的出现，必将縮小未来抗生素的使用范围。此外，由于饲料而 引发的肉食品安全问题，如疯牛病、二噁英污染、法国污水饲料等事件，至今还 令人心有余悸。因而，欧盟禁止在饲料中添加螺旋霉素、维吉尼亚霉素、杆菌肽 锌和泰乐菌素等抗生素。同时，抗生素残留超标严重制约我国畜产品的出口，鸡 肉氯羟吡啶残留超标，蜂产品"杀虫眯"和氯霉素残留超标，遭到封杀并要求销毁， 给我国造成经济损失。为此，抗生素饲料添加剂的使用对畜牧业和人类健康产生 严重的负面影响。然而，相关报告显示，禁止在词料中添加抗生素或其他抗菌促 生长剂的国家会造成畜牧业生产成本增加、盈利减少，同时也有可能引发诸如生 态环境及国家之间的贸易战等问题。面临当前的严峻形势，开发研制具有促生长 作用、低药物残留和无交叉耐药性的抗生素新品种已成为刻不容缓的事请。安来霉素是一种广谱、高效、安全的新型饲料添加剂，作为饲料添加剂，安 来霉素具有如下优点(1 )对饲料只添加微量的安来霉素就能促进对畜禽的增重。(2)具有对革兰氏阳性菌强烈的抗微生物活性。(3)不会残留于畜禽体内。(4) 与临床上现有的抗生素或抗菌药之间不存在交叉耐药性。敏感菌几乎不对安来霉 素产生耐药性，在实验条件下，耐药性的产生也非常缓慢，即使出现，耐药性也 不稳定，而且极易丢失。(5)在饲料里面可以保持稳定性。此外，安来霉素对乙 肝病毒(HBV)抗原和乙肝e抗原(HBeAg)也有较好的抑制效果。正是由于安来霉4素具有高效、安全、无残留等优点，在中国上市的短时间内，市场份额迅速上升， 已成为抗菌促生长饲料添加剂的一线产品，但目前国内尚未见安来霉素生产的相 关报道，课题组通过大量的实验研究，确定了安来霉素的最佳分离提取工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种安来霉素产生菌(链霉菌)、发酵生产安来霉素的 过程及应用大孔树脂提取安来霉素的方法。本专利技术的技术方案 一种链霉菌，其分类命名为链霉菌，菌种的拉丁学名是sp.NJYWG3665，保藏日期是2008年3月21日，保藏中心登记入 册编号是CGMCC NO.2410。本专利技术还提供了一种用大孔树脂提取安来霉素的方法，具体步骤如下A、 发酵法生产安来霉素的过程为(1)斜面培养将链霉菌5Vw^o/^CM sp. NJWGY3665菌种，中科院微生物菌种保藏中心编号CGMCC No.2410，接到葡 萄糖营养培养基中，进行斜面培养，葡萄糖营养培养基的重量百分配比为葡萄糖 0.5~1%、牛肉膏0.5~1%、蛋白胨0.5~1%、 NaC10.3 0.5。/o或K2HP04 0.1 0.20/0、 琼月旨1.5~2%、水余量，pH6.0~9.0，培养温度28 37。C，培养时间2天~6天；(2)种子培养用无菌水将斜面上培养的孢子制成单孢子悬液，并接种到50ml 种子培养基中培养，种子培养基的重量百分配比为葡萄糖1~3.0%、玉米浆1~3%、 CaC03l~2%、酵母粉0.5%、 NaCl 0.1~0.8%、水余量，pH为6.0-9.0，温度 为28 32'C，转速为200rpm，培养2天~6天；(3)发酵培养将种子液接种到 发酵培养基中培养，发酵培养基的重量百分配比为葡萄糖2.0~5.0%、淀粉 0.5~2.0%、玉米浆0.5~3.0%、酵母膏0.1-0.5%、黄豆饼粉0.5~2% 、 NaCl 0.5~1.0%、 CaC03l~2%、 NH4C1 0.5%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸铵0.3%、水余 量，温度控制在28 37'C， pH控制在6.0-9.0，转速180 220rpm，发酵5~9天； B、将发酵后的安来霉素产生菌，用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎，得 到含有安来霉素的混合物；C、用水稀释成体积分数为10%~100%的萃取剂振荡 提取B中所述的混合物0.5 4小时，体系的pH值控制在4.0-8.5之间，获得含 有安来霉素的提取液；D、将含有安来霉素的提取液离心，收集含有安来霉素的 上清液，将上清液在30 40'C下减压浓縮至无液体，得到安来霉素粗提品；E、 大孔树脂预处理后，将浓縮后的安来霉素粗提品用溶剂溶解，经过大孔树脂静止 吸附2 5小时后，用洗脱剂进行梯度洗脱、浓縮干燥后得到安来霉素纯品。上述的萃取剂为萃取剂为乙醇、甲醇、盐酸、氯化钠的甲醇水溶液、盐酸的 甲醇水溶液，其中所述的乙醇为无水乙醇、甲醇为分析纯，盐酸的摩尔浓度为 l~5mol/L，氯化钠甲醇水溶液中氯化钠摩尔浓度为0.03 0.09mol/L、甲醇体积分数为40%~70%，盐酸甲醇水溶液中盐酸摩尔浓度为0.003-0.009 mol/L、甲醇体积分数为40%~70%。萃取剂的体积分数为30%~100%,利用萃取剂提取的时间为0.5-2.5小时。 上述步骤C中安来霉素产生菌的菌丝体质量/萃取剂体积为1/10~1/150。 上述提取体系的pH为5.0~7.5。上述所选用的大孔树脂为大孔树脂D101、安伯莱特XAD-2、安伯莱特XAD-4 或安伯莱特XAD-16。梯度洗脱时，洗脱剂为甲醇体积分数30%~90%的甲醇水溶液、氯化钠摩尔 浓度为0.03 ~0.09mol/L及甲醇体积分数为40%~70%的氯化钠甲醇水溶液、盐酸 摩尔浓度为0.003~0.009 mol/L及甲醇体积分数为40%~70%的盐酸甲醇水溶液或 摩尔浓度为1 3mol/L的盐酸中的任意两种；两种洗脱剂的体积比为l:9 5:5。上述链霉菌5^印tow;;cej sp.NJYWG3665是由本实验室从南京工业大学江浦 校区的土壤中，初筛得到47株能抑制枯草芽孢杆菌生长的放线菌；经摇瓶复筛， 用HPLC (高效液相色谱)检测获得一株安来霉素产生菌，通过生理生化特性实 验和16SrDNA序列相似性分析，分类鉴定命名为链霉菌，并保藏于中国普通微 生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.2410，保藏日期是2008年3月21日。以此菌种作为生产菌株。CGMCC No.2410菌株具有下述性质1、 形态特征菌株在高氏一号培养基上生长中度，气生菌丝生长中度，孢子丝呈波曲状， 孢子成链状排列，在电子显微镜下孢子成椭圆形。2、 培养特征28。C培养7-14天，观察菌株在下列各种培养基上的特征。 表1 CGMCCNo.2410菌株的培养特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种链霉菌，其分类命名为链霉菌，菌种的拉丁学名是Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．ＮＪＹＷＧ３６６５，保藏日期是２００８年３月２１日，保藏中心登记入册编号是ＣＧＭＣＣ　ＮＯ．２４１０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨文革，胡永红，王丹丹，陈林，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]