油菜雄性不育细胞质NAU9A的育种方法技术

本发明专利技术公开了一种甘蓝型油菜雄性不育细胞质ＮＡＵ９Ａ的创建方法和特征，属于遗传工程领域和植物育种领域。利用甘蓝型油菜原生质体技术，获得了融合后代，从融合后代中发现了不育株；利用ＮＡＵ９Ｂ保持系与该不育株杂交和回交，得到了稳定不育系ＮＡＵ９Ａ。提取ＮＡＵ９Ａ不育系的线粒体ＤＮＡ，并且利用ＰＣＲ技术克隆鉴定不育胞质，得到ＮＡＵ９Ａ不育系的线粒体ＤＮＡ的一个特征序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１和其编码氨基酸序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２。本发明专利技术的细胞质和特征基因序列为首次报导。ＮＡＵ９Ａ细胞质可广泛应用十字花科植物的杂种优势利用，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了一种甘蓝型油菜细胞质及其特征线粒体DNA序列，属于遗传工程领域和植物育种领域。具体地讲，涉及十字花科植物的杂种优势利用，为十字花科植物杂交种选育提供新型不育细胞质细胞质。
技术介绍
细胞质雄性不育可以应用于杂交种生产，效益巨大，已经为人们普遍认可。细胞质雄性不育系用于配置杂交种，可提高油菜菜籽产量15%以上，也可可显著提高十字花科蔬菜的产量。目前，在油菜乃至十字花科植物中，主要应用细胞质雄性不育主要是polimaCMS、陝2A 、 OguCMS (参见刘平武等，甘蓝型油菜pol CMS育性恢复基因的分子标记中国油料作物学报，2007， 29 (1): 14—19.)。polima CMS是傅廷栋教授于1972年在甘蓝型油菜品种波里马中发现19株天然细胞质雄性不育株，后将稳定下来的不育系称polima CMS(简称pol CMS),其恢复基因位于A组染色体上，为一对显性基因。PolCMS不育性也受温度的影响，依其保持系细胞核基因的不同，可分为高温不育、低温不育和稳定不育3种类型。通过筛选，获得缺乏温度敏感基因的保持系，可育成不育性稳定的polcms系。polCMS目前的应用面最广。陕2ACMS是李殿荣(1980)于1976年在甘蓝型油菜品种间复交组合(574-3/(丰收4号+7207混合授粉)]后代中发现的半不育株，后经连续回交转育得到稳定不育系陕2A，其恢复基因为1对显性基因。陕2A与polCMS具有共同的保持系和恢复系，由其配制的三系杂种"秦油2号"是国际上第一个通过品种审定、并大面积用于生产的甘蓝型三系杂交种。Ogu CMS是由0gura(1968)在日本萝卜Raphanus sativas L.群体中发现天然雄性不育，选育得到的系统。法国Bannefot等(1977)采用连续回交的方法将这种胞质分别转育到甘蓝型油菜和甘蓝中，得到油菜萝卜质雄性不育系。oguCMS不育性稳定，所有甘蓝型油菜品种均是它的保持系，其恢复基因存在于欧洲的萝卜品种中。OguCMS生产的杂交油菜已经在英、法等国商品化生产。目前，全世界已经报导的油菜不育细胞质有22种以上，但是应用较多的细胞质主要是POLCMS。目前油菜CMS利用中还是存在一些问题，主要是①油菜CMS育性不稳定问题；②应用的CMS细胞质比较单一，让人不禁想起单一细胞质可能造成的生产损失。因此，发掘新的油菜CMS系统仍然具有十分重要的意义。3我们在油菜原生质体融合后代中，发现不育株，通过杂交和回交，获得了 NAU9A 型细胞质雄性不育系；鉴定分子线粒体DNA，证明NAU9A不育系是由线粒体重组得到的新型不育系。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于公开一种细胞质雄性不育NAU9A，该不育胞质是通 过原生质体融合后代选育而得到的。油菜及十字花科杂种优势利用中，存在不育细 胞质单一，育性不稳定等问题，本专利技术的细胞质雄性不育为解决细胞质单一问题提 供了新手段，可用于油菜及其十字花科杂种优势利用。技术方案上述NAU9A雄性不育细胞质，属于新型细胞质雄性不育类型，可用于甘蓝型油菜、 白菜等十字花科植物的杂种优势利用。通过杂交、回交等育种方式，育成NAU9A细 胞质的雄性不育系。TGA该序列编码的重组蛋白序列(SEQIDNo. 2)为R有益效果1、 本专利技术的目的在于公开一种细胞质雄性不育NAU9A，该不育胞质是通过原生 质体融合后代选育而得到的。2、 油菜及十字花科杂种优势利用中，存在不育细胞质单一，育性不稳定等问题。 本专利技术人提供的细胞质是经过线粒体基因组重组而获得的，该重组类型不同于 已经大面积应用了20年的POLIMA不育胞质类型(pol)，该不育胞质的应用将 有利于解决不育细胞质单一的问题。而且该细胞质雄性不育类型的不育性比较T 2w Ms sL T1LR K壯ss DV肌G MD KG "D wN wYF V:F AF trL Ac TJ1 Vw pF KQ ss T:Y DT Kw肛V sQ D、-TlEKssAMDA LM R化wD HA HL ^R w花KN §D SL w渔隨D Aw Dw EF EE R4彻底，易于培育彻底稳定不育系。3、 本专利技术人提供的不育胞质是线粒体基因组重组的结果利用具有NAP型胞质的可育亲本原生质体融合，获得融合杂种；由于遗传的异质性，导致线粒体DNA 重组，从而可得到的不育胞质。线粒体DNA的分子实验证明了这个结论。本发 明的细胞质雄性不育不同于NAP型细胞质雄性不育，NAP型细胞质的恢复系是 NAU9A的保持系；也不同于POLIMA型细胞质雄性不育系，POLIMA型不育 系的线粒体编码ORF224蛋白，导致雄性不育，而本专利技术的不育胞质编码重组 型ORF222R9蛋白。从利用的角度看，NAP细胞质的利用价值不大，而本专利技术 的NAU9A细胞质利用价值很大。4、 本专利技术人提供的不育胞质可以通过种间杂交，转移到白菜、甘蓝等十字花科物 种中去，为这些十字花科物种的杂种优势利用，提供细胞质雄性不育，因此应 用可以很广泛。5、 研究中，通过基因表达分析，发现NAU9A的重组型基因C^F2"/ 9在稳定不 育系中表达大，而在可育杂交组合中该重组型基因表达量低，说明该基因与雄 性不育的形成有关。具体实施例方式实施例1以播娘蒿(Z)esrwra/w'a" so/7/n'a)叶片和甘蓝型油菜(Sraw/ca "a; "s)子叶为 材料提取原生质体，采用PEG"高pH、高钙附加DMSO融合方法，液体浅层静 置培养，研究影响播娘蒿与甘蓝型油菜原生质体融合的因素，获得了 19株再生植 株。结果表明4 %纤维素酶+ 0.5 %离析酶+5 mmol/L MES酶解10h和1 %纤维 素酶+ 0.2%离析酶+3 mmol/L MES酶解14h分别适合获得高产率播娘蒿与油菜 原生质体；30%PEG + 0.3mol/L葡萄糖+ 50 mmol/L CaC12 2H20 + 15 %DMSO 获得了 10%的融合率；改良B5培养基的原生质体培养效果较好；每次添加不同 的新鲜培养基和添加MES对于防止褐化具有很好的效果；适宜分化培养基为MS + 4.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA + 5.0mg/L AgN03;适宜生根培养基为MS + 0.1mg/L IBA + 0.1mg/L NAA。甘蓝型油菜与播娘蒿的原生质体融合获得的再生植株移栽到田间后，对其进 行了形态学、细胞学及花粉活力观察。杂种植株生长缓慢、在叶型、叶片缺刻、 叶缘裂痕、茎杆分枝处颜色、花蕾初期颜色等形态学上表现出播娘蒿的特征，开 花期和成熟期相对较晚；杂种植株花比油菜花小，花粉活力低，结实率低。在融 合杂种中出现了 7个不育株，用甘蓝型油菜与融合杂种进行杂交和回交研究。实施例2利用原生质体融合技术所获得的融合杂种中，出现了不育株。用不育株了与5NAU9B杂交，进一步从杂交F1开始选择彻底不育株与NAU9A回交，经过5代回 交，得到稳定的不育系NAU9A。 NAU9A的不育性在年份间表现稳定不育。通过测 交，已经找到恢复系，实现了三系配套，为杂种优势利用提供了新的授粉控制系统。 研究开创了细胞质方法，通过该方法从融合杂种至回交一代，均发现细胞质重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞质雄性不育胞质ＮＡＵ９Ａ：利用原生质体融合技术，通过杂交和回交育种方法，得到甘蓝型油菜细胞质雄性不育系和保持系，分别命名为ＮＡＵ９Ａ和ＮＡＵ９Ｂ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：管荣展，姜淑慧，田琳琳，张红生，杜同庆，陈健美，郑秀，张丽君，张凤启，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[]