一种罗丹明B完全抗原的合成方法技术

一种罗丹明Ｂ完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明专利技术以罗丹明Ｂ为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白ＢＳＡ偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比。本发明专利技术成功合成了罗丹明Ｂ完全抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。

【技术实现步骤摘要】

一种罗丹明B完全抗原的合成方法，属于生物化工

技术介绍
罗丹明B，英文名RhodamineB; CAS:81-88-9,分子式C28H31C1N203;罗 丹明B是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料，在溶液中有强烈的荧光，用作 实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业。其为三苯甲烷类 碱性染料，具有潜在的致癌和致突变性，我国和欧盟等都不允许在食品中使用。 罗丹明B具有脂溶性，被用作调味品(主要是辣椒粉和辣椒油)染色剂。使用 了被污染的调味品制作的食品时会造成残留。调味品使用罗丹明B染色时含量 较高，甚至直接掺入，可进行现场检测。食品中因其含量较低，需送实验室检 测。可能添加的食品类别为调味品。现有的仪器检测法很难实现对罗丹明B 进行快速、准确、多残留的检测。目前国内外尚未有理想的针对罗丹明B多残 留免疫检测方法的报道。为了弥补这一空白，设计了以罗丹明B自身为半抗原 的合成罗丹明B免疫检测的完全抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种罗丹明B完全抗原的合成方法。所制备的产品用 于罗丹明B的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。本专利技术的技术方案 一种罗丹明B完全抗原的合成方法，以罗丹明B为半 抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶 联比；步骤为(1)罗丹明B完全抗原的合成配制A液20mg罗丹明B溶于lmL DMF中，全溶后冰浴下加10pL三丁 氨混匀后再加10pL氯甲酸异丁酯磁力搅拌lh;配制B液40mgBSA溶于3mLpH7.4的磷酸盐缓冲液中，4'C保存备用；冰浴下将A液逐滴加入B液中，然后置4'C下温孵3h，即得罗丹明B完全 抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60'C的去离 子水冲洗3min，保存在4'C去离子水中备用；透析:将罗丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2 X 2L的0.01M的pH7.4 的磷酸盐缓冲溶液和2X2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中 的液体制成粉末，即得到罗丹明B完全抗原；(2)罗丹明B完全抗原的鉴定罗丹明B完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩尔吸光系数s，再测定罗丹明B完全抗原的偶联比。偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量 (或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓 度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联 物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， lOO吗'mL.1的牛血清蛋 白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，3(TC水浴温热5分钟， 每个浓度做平行样，在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。 将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得 到抗原溶液的相应的蛋白浓度。摩尔吸光系数e:配制罗丹明B浓度为O， 10， 20， 30 ^mL"的20%乙醇 溶液，通过紫外扫描可知罗丹明B的最大吸收波长为564nm，在564nm处测吸 光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为￡=吸光值/摩尔浓度。偶联比测定配制150^mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，将偶联产物完 全抗原用20%乙醇稀释到150(ig'ml/1，在312nm处测吸光值，以20%乙醇为空 白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为Al，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比 率r为,=[(4-4)/sl/(150xl(T3/66200)，其中s为摩尔吸光系数(L'tnol—1 )， 66200 为牛血清蛋白的分子量，150xl(^为牛血清蛋白浓度(吸mL—1)。本专利技术的有益效果本专利技术成功合成了罗丹明B的人工抗原，合成步骤简 洁，有效，可完全用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径， 可以满足国内对其研究的需要。 附图说明图l罗丹明B人工抗原制备前后的紫外扫描图。具体实施例方式实施例1(1)罗丹明B完全抗原的制备 配制A液20mg罗丹明B溶于lmL DMF，全溶后冰浴下加10pL三丁氨混匀后再加10pL氯甲酸异丁酯磁力搅拌lh。配制B液40mgBSA溶于3mLpH7.4的磷酸盐缓冲液中，《C保存备用。 冰浴下将A液逐滴加入B液中，然后置4'C下温孵3h。即得罗丹明B完全抗原混合液。透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去离子水冲洗3min，保存在4"C去离子水中备用。透析:将罗丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2 X 2L的0.01M的pH7.4 的PBS溶液和2X2L的去离子水透析3天。最后使用冷冻干燥法将透析袋中的 液体制成粉末，即得到罗丹明B完全抗原。2)罗丹明B人工抗原的鉴定偶联物蛋白浓度测定配制浓度为O, 40， 60， 80， 100吗.mL.1的牛血清蛋 白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，3(TC水浴温热5分钟， 每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度与吸光值的关 系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从 曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为 3.28mg-ml/1。摩尔吸光系数s:配制罗丹明B浓度为O， 10， 20， 30吗'mL"的20%乙醇 溶液，通过紫外扫描可知罗丹明B的最大吸收波长为564nm，在564nm处测吸 光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为￡=吸光值/摩尔浓度。本实验 计算得e=7737.3 L'mo1—1偶联比测定配制150昭'mL"牛血清蛋白的2(P/。乙醇溶液，将偶联产物用 20%乙醇稀释到150pg'mL"，在564nm处测吸光值，以20%乙醇为空白，测出 牛血清蛋白溶液的吸光值为Al,偶联产物的吸光值为A2，偶联比率r为 "/(150x10-3/66200)，则偶联比率r为11.67,其中s为摩尔吸光系数(L-mor1)， 66200为牛血清蛋白的分子量，150xl(T3为牛血清蛋白浓度((ig-mL-1)。权利要求1、一种罗丹明B完全抗原的合成方法，其特征是以罗丹明B为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；步骤为(1)罗丹明B完全抗原的合成配制A液20mg罗丹明B溶于1mL DMF中，全溶后冰浴下加10μL三丁氨混匀后再加10μL氯甲酸异丁酯磁力搅拌1h；配制B液40mg BSA溶于3mLpH 7.4的磷酸盐缓冲液中，4℃保存备用；冰浴下将A液逐滴加入B液中，然后置4℃下温孵3h，即得罗丹明B完全抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；透析将罗丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种罗丹明Ｂ完全抗原的合成方法，其特征是以罗丹明Ｂ为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白ＢＳＡ偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；步骤为：　（１）罗丹明Ｂ完全抗原的合成：　配制Ａ液：２０ｍｇ罗丹明Ｂ溶于１ｍＬ　ＤＭＦ中，全溶后 冰浴下加１０μＬ三丁氨混匀后再加１０μＬ氯甲酸异丁酯磁力搅拌１ｈ；　配制Ｂ液：４０ｍｇ　ＢＳＡ溶于３ｍＬ　ｐＨ７．４的磷酸盐缓冲液中，４℃保存备用；　冰浴下将Ａ液逐滴加入Ｂ液中，然后置４℃下温孵３ｈ，即得罗丹明Ｂ完全抗原混合 液；　透析袋前处理：取１０ｃｍ的透析袋，于沸水中煮沸５ｍｉｎ，再用６０℃的去离子水冲洗３ｍｉｎ，保存在４℃去离子水中备用；　透析：将罗丹明Ｂ完全抗原混合液移入透析袋中，用２×２Ｌ的０．０１Ｍ的ｐＨ７．４的磷酸盐缓冲溶液和２×２Ｌ 的去离子水透析３天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到罗丹明Ｂ完全抗原；　（２）罗丹明Ｂ完全抗原的鉴定：罗丹明Ｂ完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计 算摩尔吸光系数ε，再测定罗丹明Ｂ完全抗原的偶联比。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，宋珊珊，林菲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]