一种柠檬黄完全抗原的合成方法技术

一种柠檬黄完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明专利技术以柠檬黄为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白ＢＳＡ偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比。本发明专利技术成功合成了柠檬黄的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对柠檬黄研究的需要。

【技术实现步骤摘要】

一种柠檬黄的通用人工抗原的合成方法，属于生物化工

技术介绍
柠檬黄色素(Tar)是目前我国批准使用的六种食用合成色素之一，其分子结 构为偶氮化合物，在体内代谢的产物为对人体具有潜在危害的一芳香类化合物。 因此，我国对在食品中的柠檬黄色素有严格限制。凡是肉类及其加工品，鱼类 及其加工品等都不能使用人工合成色素，即使在适用的品种和范围内，使用剂 量也有严格规定，决不允许过量使用。但实际上，我国食品中普遍存在柠檬黄 色素的超标、超范围使用现象屡禁不止。如果人们长期或一次性大量食用拧檬 黄含量超标的食品，可能会引起过敏、腹泻等症状，当摄入量过大，超过肝脏 负荷时会在体内蓄积，对肾脏、肝脏产生一定伤害。目前，检测柠檬黄含量采 取的方法是薄层分析及分光光度法，近年来，我国科研工作者在柠檬黄检测方 面做了大量的工作，但都主要集中在理化检测方面，这些方法不仅需要昂贵的 仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本 前处理才能进行，这己经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。近年 来，国内外已经开展了对色素类免疫分析方法的研究，但国内外尚没有针对拧 檬黄的酶联免疫检测的报道，为了弥补这一空白，有必要制备柠檬黄完全抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种拧檬黄完全抗原的合成方法。所制备的产品用于 柠檬黄的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。本专利技术的技术方案 ，以拧檬黄为半抗原， 用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比； 步骤为(1)柠檬黄完全抗原的合成配制A液取53.4mg (O.lmmol)柠檬黄溶于2mL 二甲亚砜(DMSO)中， 冰浴10min，加入51pL三正丁胺，冰浴10min，加入87^L氯甲酸异丁酯，4°C 下，搅拌孵育lh，为A液，4t:保存备用；配制B液130mg (0.002 mmol)牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01 mol/LpH 7.4PBS缓冲液，为B液，4"C保存备用；冰浴条件下把A液逐滴滴加入B液中，边加边摇，于4。C下孵育4h,即得拧 檬黄完全抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60。C的去离 子水冲洗3min，保存在4'C去离子水中备用。透析将柠檬黄完全抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01 mol/L的 pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2X2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透 析袋中的液体制成粉末，即得到柠檬黄完全抗原；(2)柠檬黄完全抗原的鉴定柠檬黄完全抗原采用分光光度法鉴定其偶 联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的 蛋白浓度，计算摩尔吸光系数e，再测定柠檬黄完全抗原的偶联比。偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方 法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量 (或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓 度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联 物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。摩尔吸光系数s:配制柠檬黄浓度为O， 10， 20， 30吗'mL'1的0.01M的PBS 溶液，通过紫外扫描可知拧檬黄的最大吸收波长为427nm,在427nm处测吸光 值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为^吸光值/摩尔浓度。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 10， 20， 40， 60， 80， 100吗'mL" 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30'C水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光 值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光 值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。偶联比测定配制150吗.mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，将偶联产物人 工抗原用20%乙醇稀释到150吗.ml/1，在427nm处测吸光值，以20%乙醇为空 白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为Al，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比 率r为Z = /(l50x1 (r3/66200)。其中s为摩尔吸光系数(L'mor1)， 66200为牛血清蛋白的分子量，150xl0—3 为牛血清蛋白浓度(^mL-1^本专利技术的有益效果本专利技术合成了柠檬黄完全抗原，合成步骤简洁，有效， 完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内 对其研究的需要。 附图说明图l柠檬黄完全抗原制备前后的紫外扫描图。 具体实施方法 实施例1 (1)柠檬黄完全抗原的制备4配制A液取拧檬黄53.4mg (O.lmmol)溶于2mL DMSO中，冰浴10min，加入51mL三正丁肢，冰浴10min，加入87pL的氯甲酸异丁酯，4。C下，搅拌孵 育lh，为A液。配制B液130mg (0.002 mmol)牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01 mol/LPBS 缓冲液，为B液。把A液逐滴滴加入B液中，边加边摇，于4'C下孵育4h，即 得柠檬黄完全抗原混合液。透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60'C的去离 子水冲洗3min，保存在4t去离子水中备用。透析将柠檬黄完全抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M的PBS 溶液和2X2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉 末，即得到柠檬黄完全抗原。(2)柠檬黄完全抗原的鉴定摩尔吸光系数s:配制拧檬黄浓度为O, 10， 20， 30 ng'ml/1的0.01M的PBS 溶液，通过紫外扫描可知柠檬黄的最大吸收波长为427nm，在427nm处测吸光 值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为^吸光值/摩尔浓度。本实验计 算得￡=25649.76 L'mor1。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 10， 20， 40， 60， 80， 100吗'mL" 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30。C水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光 值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光 值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白 浓度为3.35mg'mL"。偶联比测定配制150^mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，将偶联产物用 20%乙醇稀释到150吗.ml/1，在427nm处测吸光值，以20%乙醇为空白，测出 牛血清蛋白溶液的吸光值为Al，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比率r为 ,-/(150x1(TV66200)，本实验计算得r&18 。其中s为摩尔吸光系数(Lmor1)， 66200为牛血清蛋白的分子量，150xl(T3 为牛血清蛋白浓度(吸ml/1)。权利要求1、，其特征是以柠檬黄为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；步骤为(1)柠檬黄完全抗原的合成配制A液取53.4mg柠檬黄溶于2mL DMSO中，冰浴10min，加入51μL三正丁胺，冰浴10min，加入87μL氯甲酸异丁酯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柠檬黄完全抗原的合成方法，其特征是以柠檬黄为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白ＢＳＡ偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；步骤为：　（１）柠檬黄完全抗原的合成：　配制Ａ液：取５３．４ｍｇ柠檬黄溶于２ｍＬ　ＤＭＳＯ中，冰浴１ ０ｍｉｎ，加入５１μＬ三正丁胺，冰浴１０ｍｉｎ，加入８７μＬ氯甲酸异丁酯，４℃下，搅拌孵育１ｈ，为Ａ液，４℃保存备用；　配制Ｂ液：１３０ｍｇ牛血清蛋白ＢＳＡ溶于２ｍＬ　０．０１ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．４ＰＢＳ缓冲液，为Ｂ液，４℃保存备 用；　冰浴条件下把Ａ液逐滴滴加入Ｂ液中，边加边摇，于４℃下孵育４ｈ，即得柠檬黄完全抗原混合液；　透析袋前处理：取１０ｃｍ的透析袋，于沸水中煮沸５ｍｉｎ，再用６０℃的去离子水冲洗３ｍｉｎ，保存在４℃去离子水中备用。　透析：将 柠檬黄完全抗原混合液移入透析袋中，用２×２Ｌ的０．０１ｍｏｌ／Ｌ的ｐＨ７．４的磷酸盐缓冲溶液和２×２Ｌ的去离子水透析３天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到柠檬黄完全抗原；　（２）柠檬黄完全抗原的鉴定：柠檬黄完全抗原采用分 光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩尔吸光系数ε，再测定柠檬黄完全抗原的偶联比。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，林菲，宋珊珊，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]