草莓角斑病菌的检疫鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种草莓角斑病菌的检疫鉴定方法，其特征在于，它 包括现场检疫、病原菌分离纯化、病原菌形态观察及生理生化测定、致 病性测定、PCR法检测等步骤。本发明专利技术通过研究草莓角斑病菌的生理生化 特征，并对病原菌进行分离、纯化、再培养，优化培养基配比，建立了 以形态学、分子生物学等为手段的检疫鉴定方法，该方法具有准确、高 效和快速等特点，对防控草莓角斑病菌对我国草莓业的危害具有重大意 义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种病菌的检疫鉴定方法，特别是草莓细菌性角斑病菌的检疫鉴定方法。
技术介绍
草莓角斑病(Angular leaf spot of strawberry)病原菌为草莓角斑病菌(J朋t力。膨朋s /hs卵zvz'ae Kennedy & King)， 该菌属于原核生物界(Procaryote)，薄壁细菌门(Gracilicutes)，暗细菌纲(Scotobacteria)，假单胞杆菌禾斗(Pseudomonadaceae)， 黄单胞杆菌属(t力o/z7cv7a51)。草莓角斑病菌的寄主范围草莓(,rs卵ria s朋/7a^a)是该病原菌的主要寄主。病原菌对草莓属(/^^an's)的其它品种的致病性变化较大。人工接种情况下，弗州草莓(,.7i/^i'/2i'朋a)、野草莓(,.yesca)、金露梅(尸ote/7ti'"a /r""coss)和委陵菜(尸.^a/7oWosa)均可被草莓角斑病菌侵染。草莓属植物中仅麝香草莓(,.历osc力a^)对草莓角斑病菌免疫。草莓角斑病菌的生物学特性是病叶残渣和带菌植株是发病的初次侵染源。在病残叶和土壤中，病菌能够存活到下茬作物；在实验室保存的干燥病叶片中，病原菌至少可存活两年半。在草莓开始生长时，病原菌由病残叶传播到幼叶上，细菌可从侵染区沿着幼叶基部叶脉扩散，在田间传播主要靠雨水、喷灌及风的作用传播。病原菌可通过气孔侵入，也可经过局部伤口或下方的病叶侵染，在整个生长期发生多个侵染循环，病菌可侵染植物的花，但不侵染果实。中等偏低的日温(大约20。C)、夜间低温及较高的湿度更有利于该病菌的侵染。草莓角斑病菌的传播途径草莓角斑病菌可以通过雨水和田间灌溉飞溅 作局部传播、扩散，携带病菌的草莓苗以及夹杂在草莓苗中的病残体都可能 随贸易作短距离和长距离的运输传播。国内对的研究为空白，而在国外相关的草 莓角斑病菌的检疫鉴定方法研究中，虽然进行生物学和分子方法的检疫鉴定 研究，但其检疫鉴定方法缺乏系统性和完整性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种准确、高 效和快速的。本专利技术是一种进出境植物检疫中草莓角斑病菌X^Aomomw /ragaW^ Kennedy & King的检疫和鉴定方法，适用于进出境草莓种苗中草莓细菌性角 斑病菌1<3"// 麵。"0 戶agar/ae Kennedy & King的检疫禾口鉴定。以下对本专利技术进行详细阐述。1、 引用文件GB/T 4789.28—2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂； SN/T1157进出境植物苗木检疫规程。2、 原理病害的症状、病原菌的形态特征、生物学特性、生化特性、致病性测定， 以及分子生物学特征是本专利技术检疫鉴定方法的依据。3、 仪器和用具生物显微镜、生化培养箱、高压灭菌器、电子天平(感量0.0001)、恒温 振荡培养箱、超净工作台、PCR仪、电泳装置、恒温水浴锅、高速冷冻离心 机、移液器、移液器枪头、研钵、量筒、烧杯、培养皿、PCR管、离心管、 接种针、玻璃棒、剪刀等。4、 主要试剂蛋白胨、酵母膏、蔗糖、葡萄糖、琼脂粉、冰乙酸、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)、十六垸基三乙基溴化铵(CTAB)、三羟甲基氨基甲垸(Tris)、 十二垸基磺酸钠(SDS)、液氮、酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖(电 泳用)、溴化乙锭(EB)、7^DNA聚合酶、氯化钾(KC1)、磷酸氢二钾(K2HP04)、 氯化钠(NaCl)、磷酸氢二钠(Na2HP04)、氯化镁(MgCl2)、硫酸镁 (MgS04-7H20)、硝酸钠(NaNO"、乙二胺四乙酸钠(Na2EDTA)、溴酚蓝、 蛋白酶K、 RNaseA、 10xPCR缓冲液、dNTP (dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP)。5、检疫鉴定方法5. 1现场检疫抽样数按SN/T 1157中规定的方法进行。在现场检疫时，应仔细检查草莓苗叶和茎有无病变症状，如在草莓叶面 上发现水渍状红褐色不规则形病斑、叶背溢出菌脓、植株生长点变黑等可疑 症状时，应取样作实验室鉴定。在产地检疫和隔离试种期间，还要注意检查有无淡红褐色干枯病叶或生 长点死亡的植株，当发现可疑症状应取样作实验室鉴定。5. 2病原菌分离纯化选取新发病的、带有水渍状病斑的病叶，用70%的乙醇进行表面消毒， 切取病健交界处，无菌水冲洗后碾碎，置于PBS缓冲溶液中10min 15min。 在无菌操作条件下吸取稀释液均匀涂布于WILBRINK-N培养基平板上，置于 25'C培养5d 7d，然后再进行三次的纯化，最后获得纯菌株。5. 3病原菌形态观察及生理生化测定5.3. 1形态观察对分离纯化获得的纯菌株，经染色制成玻片，在显微镜下观察形状，测 量大小。5. 3. 2菌落颜色将菌株在WILBRINK-N或YPGA培养基上划线培养，置于25 °C培养5 d 7d，观察菌落的颜色和形状。 5. 3. 3生理生化测定 该菌株生理生化测定方法如下 C. 1革兰氏染色法按GB/T4789. 28-2003中2. 2规定的方法进行。 C. 2鞭毛染色法按GB/T4789. 28-2003中2. 7规定的方法进行。 C. 3草莓角斑病菌与近似种的区别 草莓角斑病菌与近似种草莓细菌性叶斑病菌(丄ar&n'coh pv. /ra卵r/ae )及甘蓝黑腐病菌(Z ca^pestrA)的区别见表1。表i草莓角斑病菌与草莓细菌性叶斑病菌及甘蓝黑腐病菌的区别<table>table see original document page 7</column></row><table>注ND未测定5. 4致病性测定将WILBRINK-N或YPGA培养液中培养3 d 5 d的菌株，用PBS缓冲溶 液稀释到109cfli/ml，选取完全健康的草莓感病品种，用蘸取悬浮液的接种针 小心地扎刺新生叶面，每片叶扎刺5次 10次，最好不要扎穿叶子，设置五个重复，以PBS缓冲溶液为对照。接种后用塑料袋罩住植株，使植株置于20°C 25°C、相对湿度》80%的隔离温室里生长4个星期，每天观察并记录发病情况，出现症状后，用5.2方法进行病原菌再分离、纯化。草莓角斑病菌用培养基、缓冲液配方如下B. 1 WILBRINK-N培养基蔗糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.25 g/L，硝酸钠0.25g/L,琼脂15.0g/L， pH7.2。B. 2 WILBRINK-N培养液蔗糖10.0g/L,蛋白胨5.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.25 g/L，硝酸钠0.25g/L， pH7.2。B. 3 YPGA培养基葡萄糖20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，琼脂15.0g/L， pH7.2。B.4 YPGA培养液葡萄糖20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L， pH7,2。B. 5 PBS缓冲液氯化钠8.0 g/L，氯化钾0.2 g/L，磷酸氢二钠2.9 g/L，磷酸氢二钾0.2 g/L，pH7.2。5. 5 PCR法检测采用PCR凝胶电泳检测，方法如下D. 1病原细菌DNA的提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种草莓角斑病菌的检疫鉴定方法，其特征及步骤如下：　（１）现场检疫：检查草莓苗叶和茎有无病变症状，当在草莓叶面上发现水渍状红褐色不规则形病斑、叶背溢出菌脓或植株生长点变黑的可疑症状时，取样；在产地检疫和隔离试种期间，还要注意检查有无淡 红褐色干枯病叶或生长点死亡的植株，当发现可疑症状时，取样；　（２）病原菌分离纯化：取步骤（１）抽取的病叶，用７０％的乙醇进行表面消毒，切取病健交界处，无菌水冲洗后碾碎，置于ＰＢＳ缓冲溶液中１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ；在无菌操作条件下吸取稀 释液均匀涂布于ＷＩＬＢＲＩＮＫ－Ｎ培养基平板上，置于２５℃培养５ｄ～７ｄ，然后再进行三次的纯化，最后获得纯菌株；　（３）病原菌形态观察及生理生化测定：ａ形态观察：对分离纯化获得的纯菌株，经染色制成玻片，在显微镜下观察形状，测量大小；ｂ 菌落颜色：将纯菌株在ＷＩＬＢＲＩＮＫ－Ｎ或ＹＰＧＡ培养基上划线培养，置于２５℃培养５ｄ～７ｄ，观察菌落的颜色和形状；ｃ生理生化测定：采用ＧＢ／Ｔ４７８９．２８中革兰氏染色法和鞭毛染色法进行；　（４）致病性测定：将ＷＩＬＢＲＩＮＫ－Ｎ或 ＹＰＧＡ培养液中培养３ｄ～５ｄ的菌株，用ＰＢＳ缓冲溶液稀释到１０↑［９］ｃｆｕ／ｍｌ，选取完全健康的草莓感病品种，用蘸取悬浮液的接种针小心地扎刺新生叶面，每片叶扎刺５次～１０次，设置五个重复，以ＰＢＳ缓冲溶液为对照；接种后用塑料袋罩住植株，使植株置于２０℃～２５℃、相对湿度≥８０％的隔离温室里生长４个星期，每天观察并记录发病情况，出现症状后，用步骤（２）所述方法进行病原菌再分离、纯化；　（５）ＰＣＲ法检测：采用ＰＣＲ凝胶电泳检测，方法如下：　病原细菌ＤＮＡ的提取： 　取待测样品或分离培养菌株，利用ＤＮＡ提取试剂盒方法提取ＤＮＡ，并测定ＤＮＡ浓度，－２０℃保存备用；也可直接用培养的菌株稀释悬浊液作为模板进行ＰＣＲ反应；　阴性对照、阳性对照和空白对照的设置：　阴性对照：以待测健康的草莓叶 片ＤＮＡ为模板；阳性对照：采用草莓角斑病菌或含有待测基因序列的质粒；空白对照：设两个，一是提取ＤＮＡ时设置的提取空白对照，二是ＰＣＲ反应的空白对照；　琼脂糖凝胶电泳：　制备２％的琼脂糖凝胶，用ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ作为分子量标记 ，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察并拍摄记录；　结果判断：若有５３７ｂｐ大小的产物带出现，可判定为阳性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天鸿，魏厚德，杨万风，赵文军，张梅，张连军，孟祥龙，
申请(专利权)人：刘天鸿，魏厚德，杨万风，赵文军，张梅，张连军，孟祥龙，
类型：发明
国别省市：32