本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的乳糖诊断／测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定乳糖浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学／食品检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、腺苷三磷酸、乳糖酶、葡萄糖激酶、醛糖－６－磷酸还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种乳糖诊断/测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定乳糖浓度的方法，属于医学/食品检验测定
技术介绍
乳糖是婴幼儿主要的能量来源，进入体内后经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是婴幼儿脑发育的必需物质，与婴幼儿大脑的迅速成长有密切联系。为防止乳 清粉中掺加用其他还原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的检测十分必要。 牛奶是一种营养丰富的食品，但如饮用不当，也会给健康带来不良影B向。很多人在 饮奶后出现腹部不适、腹胀、多屁、腹痛甚至腹泻等症状，这种现象在医学上称为乳糖不耐 受症，其原因是这些人小肠缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖进入结肠后，经结肠 中的细菌发酵，产生大量气体、醋酸等物质所致。大量研究证实，患有乳糖不耐受的人还有 大部分没有任何症状、只有人体生化指标改变的隐性不耐受者，医学上称为乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 据统计，全世界都存在乳糖不耐受的问题，其中亚洲人发生率最高，为 95%-100%。据中国疾病控制中心调查，我国北京、上海、广州等地3_13岁儿童乳糖不耐受 症和乳糖吸收不良的发生率约为80%。乳糖不耐受除引起消化道症状外，还可造成人体营 养吸收不良。据国外研究，乳糖不耐受可减少钙的摄入、减少峰值骨量、增加骨丢失从而引 发骨质疏松症，乳糖不耐受可影响铁和锌的吸收，造成铁缺乏和锌缺乏，并可影响小儿的脑 发育，对人体健康危害很大。 在食品分析领域中，酶分析法是广为使用并倍受诸如ISO等国际标准机构推荐的 一种方法。酶析法理论发展成熟并且已为实验室普遍接受。使用高质量经纯化的酶可以实 现对复杂物质中特定成份的检测。该方法可以检测的目标代谢物有糖类、酸类及其盐类、醇 类和其他物质等。由此，各种食品样品均可被快速检测并获得良好的结果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乳糖浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现 该方法的乳糖诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全 自动生化分析仪上进行乳糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推 广应用。 本专利技术乳糖浓度测定方法如下 乳糖+水乳糖酶半乳糖+葡萄糖 葡萄糖+腺苷三磷酸葡萄糖激酶腺苷二磷酸+葡萄糖6-磷酸 葡萄糖6-磷酸+还原型辅酶醛糖-6-磷酸还原酶山梨醇6-磷酸+辅酶 这种方法应用乳糖酶(lactase ;EC 3. 2. 1. 108)酶(偶)联葡萄糖激酶 (glucokinase ;EC 2. 7. 1. 2)、醛糖_6_磷酸还原酶(aldose-6-phosphate reductase ;EC 1. 1. 1. 200)酶促反应比色终点法。乳糖酶酶解乳糖反应产生葡萄糖，再通过(偶)联合葡 萄糖激酶、醛糖-6-磷酸还原酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成 为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程 度，通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算乳糖的浓度大小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术乳糖诊断/测定试剂(盒)较为理想 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L还原型辅酶 0. 25mmol/L 乳糖酶 6000U/L 葡萄糖激酶 8000U/L 醛糖-6-磷酸还原酶 10000U/L 腺苷三磷酸 7mmol/L 本专利技术的乳糖诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乳糖酶、葡萄糖激酶、醛糖-6-磷酸还原酶、腺苷三磷酸。 试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定乳糖浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。 具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一 本实施例的乳糖诊断/测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 还原型辅酶 0. 25mmol/L 乳糖酶 6000U/L 葡萄糖激酶 8000U/L 醛糖-6-磷酸还原酶 10000U/L 腺苷三磷酸 7mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。 实施例二 本实施例的乳糖诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 50mmol/L 还原型辅酶 0. 25mmol/L 腺苷三磷酸 7mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 乳糖酶 6000U/L 葡萄糖激酶 8000U/L 醛糖-6-磷酸还原酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂1 、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。5 实施例三本实施例的乳糖诊断/; 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷稳定剂还原型辅酶腺苷三磷酸试剂2三(羧甲基)氨基甲烷 稳定剂J定试剂为三试剂，包括盐酸缓冲液盐酸缓冲液醛糖_6-磷酸还原酶 试剂3三(羧甲基)氨基甲烷 稳定剂 乳糖酶100,1/ 50mmol/L 0. 25,1/L 7mmol/L100,1/ 500,1/L 8000U/L 10000U/L盐酸缓冲液100,1/L 500,1/L 6000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定乳糖浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始 吸光度1. 8±0. 7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂1、试剂2、试 剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右， 检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度下降的程本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的乳糖浓度测定方法，其方法如下： 乳糖＋水 乳糖酶 半乳糖＋葡萄糖 葡萄糖＋腺苷三磷酸 葡萄糖激酶 腺苷二磷酸＋葡萄糖６－磷酸 葡萄糖６－磷酸＋还原型辅酶 醛糖－６－磷酸还原酶 山梨醇６－磷酸＋辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度，测算出乳糖的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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